归脾汤对慢性睡眠剥夺大鼠HPA轴功能及单胺类神经递质的影响

张 敏，黄俊山，张一帆，曾雪爱，王秀峰，陈铭奇，张 娅

（1.福建省中医药科学院，福建 福州 350003；2.福建省中医睡眠医学重点实验室，福建 福州 350003；3.黄俊山福建省名老中医药专家传承工作室，福建 福州 350003）

慢性失眠发生与下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）及脑内多种神经递质密切相关，病情大多反复难愈，根治困难。归脾汤（Gui Pi Decotion，GPD）是临床治疗心脾两虚型失眠的经典方，广泛应用于临床，但其治疗慢性失眠的机制尚不明确。HPA 轴是最原始的内源性昼夜节律调节系统，其中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质醇（CORT）是HPA 轴重要的组成激素，与睡眠密切相关［1］。HPA 轴能调控脑内多种神经递质，其失常可导致单胺类递质如5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）等的改变。因此，本实验通过改良水平台法建立大鼠慢性睡眠剥夺模型，探讨GPD 对CRH、ACTH 和CORT 以及5-HT、5-HIAA、NE、DA 含量的影响。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF 级SD 雄性大鼠48 只，8～9 周龄，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（沪）2018-0006，在福建省中医药科学院比较医学实验中心饲养1 周。饲养环境安静，恒温（22±1）℃，每日12 h 固定照明（8：00 开灯），并可自由摄取食物和水，合格证号为SYXK（闽）2016-0005。本实验获得福建省中医药科学院动物伦理委员会批准（审批号：FJATCMIAEC2020010）。

1.2 药物与主要试剂 人参、木香、远志、当归、白术、茯神、黄芪、龙眼肉、炒酸枣仁、炙甘草（福建省鹭燕医药有限公司，批号：190601、1907028077、190901、190515、1905018082、190901、190522、190808、190620、190820-010）；艾司唑仑（济川药业集团有限公司，批号：20200501）；CRH、ACTH、CORT 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国Trust Specialty Zeal公司，型号：RG-28912、R6404、RG18882）；水合氯醛（北京雷根生物技术有限公司，货号：R00635）；5-HT、5-HIAA、NE、DA 试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21833、B27047、B24713、B25300）。

1.3 主要仪器 Rayto RT-6100 酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；Rigol L3000 高效液相色谱仪（普源精电科技股份有限公司）；Kromasil C18 反相色谱柱（荷兰Nouryon 公司）。

2 方 法

2.1 实验方法

2.1.1 GPD 药液的制备 称取人参10 g，木香10 g，远志10 g，当归10 g，白术20 g，茯神20 g，黄芪20 g，龙眼肉20 g，炒酸枣仁20 g，炙甘草5 g。先量取10倍总量冷水浸泡30 min，武火煮沸后文火继续煮20 min，过滤，收集滤液；次煎再加冷水没过中药，武火煮沸后文火继续煮30 min，过滤。将两份滤液合并，浓缩至1.86 g/mL GPD 药液。将药液与蒸馏水分别按1∶1及1∶3稀释，可得0.93 g、0.47 g/mL GPD 药液。

2.1.2 大鼠慢性睡眠剥夺模型制备 将48 只大鼠随机分为正常对照组8 只及造模组40 只，造模组大鼠均通过改良水平台法进行慢性睡眠剥夺。参考文献［2］，造模组大鼠每天（16：00—次日10：00）睡眠剥夺18 h，次日（10：00—16：00）放回笼内休息6 h，实验周期为21 d。正常对照组采用大平台实验环境，不进行任何处理，标准化饲养。若大鼠出现白天活动增加，夜间慵懒喜卧，昼夜节律紊乱，喜静少动，饮食减少，体质量降低，反应迟钝，时有焦虑易激惹现象，较正常对照组明显不同，提示模型制备成功［2］。

2.1.3 分组与给药 除正常对照组外，将造模成功的大鼠按分层随机分组方法分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及艾司唑仑组，每组8 只。造模第15 天，低、中、高剂量组分别以0.47、0.93、1.86 g/mL GPD（相当于临床人日用量的3、6、12倍），艾司唑仑组以0.009 mg/mL 艾司唑仑（相当于人临床日用量的6倍），正常对照组及模型组以生理盐水，均按1 mL/100 g 体质量灌胃。每天1 次，连续7 d。

2.1.4 组织标本的采集 造模后21 d 给药后开始禁食、禁水，24 h 之后用戊巴比妥钠（1 mL/100 g）麻醉大鼠，腹主动脉采血；后断头，剪开头皮，用血管钳揭去颅骨和硬脑膜，剪断双侧视神经后用眼科镊子迅速取出大鼠的整个脑组织；冰上剥离全脑，分离下丘脑和前额叶组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，放入事先进行标号处理的锡纸包裹好，存入液氮中，转存于-80 ℃冰箱待测。

2.2 观察指标

2.2.1 大鼠一般状态观察 大鼠的精神活动状态、皮毛颜色是否有光泽、进食饮水量、对外界刺激的反应及体质量变化等。

2.2.2 血清和下丘脑中CRH、ACTH、CORT 含量测定 将下丘脑用PBS制成10%的组织浆液，低温离心15 min，吸取上清液；血清低温离心15 min，吸取上清液，严格按试剂说明书，采用ELISA 测定血清和下丘脑组织中CRH、ACTH、CORT 含量。

2.2.3 前额叶5-HT、5HIAA、DA、NE 含量测定 称取约0.1 g 大鼠前额叶样本，加入0.01mol/L HCLO4溶液进行前处理，冰浴匀浆，冰水浴超声30 min。8 000g离心10 min，取上清液，针头式过滤器过滤后，制备成供试品溶液待测。精确称取5-HT、5HIAA、DA、NE，分别用水溶解，定容成10 mL 配成标准品溶液后待测。色谱条件：Kromasil C18 反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相的配制：20 mmol/L 磷酸二氢钾的水溶液，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，荧光激发波长为285 nm，发射波长为318 nm。用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。分别精密量取5-HT、5HIAA、DA、NE 标准品溶液、供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪测定，即得。

2.2.4 统计学方法 实验数据采用SPSS 26.0 软件分析。计量资料符合正态分布的以（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；不符合正态分布的以中位数和四分位数来表示，采用非参数检验。

3 结 果

3.1 各组大鼠一般状态 正常对照组大鼠精神状态佳，活动灵敏，毛发光泽干净，饮食正常，白天慵懒喜卧，夜间兴奋好动。模型组大鼠昼夜节律紊乱，精神倦怠，皮肤色泽暗淡，毛发枯燥，喜静少动，饮食减少，体质量降低，时有焦虑易激惹现象。经治疗后，GPD 各剂量组和艾司唑仑组大鼠一般状态均有不同程度的改善。

3.2 各组大鼠血清和下丘脑中CRH、ACTH、CORT含量比较 血清中上述指标以中、低剂量组降低最为显著，最接近正常对照组，下丘脑中上述指标以中剂量组降低最为显著，最接近正常对照组。据此推测慢性睡眠剥夺大鼠会引起HPA 轴功能亢进，见表1～表2。

3.3 各组大鼠前额叶5-HT、5-HIAA、NE、DA 含量比较 5-HT 和5-HIAA 升高以中剂量组效果最佳，最接近正常对照组，NE 和DA 降低分别以高剂量组和中剂量组效果最佳，最接近正常对照组，见表3。

表3 各组大鼠血浆中单胺类神经递质含量比较（xˉ±s） ng/g

4 讨 论

GPD 是临床治疗慢性失眠重要而有效的方剂，王燕等［3］以GPD 加减治疗失眠患者32 例，总有效率为93.75%，证实本方能够有效改善睡眠质量。现代研究表明：GPD 能明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间，具有镇静催眠作用，能提高动物脑内单胺类神经递质5-羟色胺、多巴胺等含量，但其治疗慢性失眠的作用机理尚不明确［4］。

本实验采用改良水平台复制大鼠慢性睡眠剥夺模型，观察不同剂量GPD 治疗慢性失眠可能的作用机制。本实验结果表明：慢性睡眠剥夺大鼠昼夜节律紊乱，精神倦怠，皮肤色泽暗淡，毛发枯燥，喜静少动，饮食减少，体质量降低，提示模型制备成功。经GPD 治疗后，大鼠的一般状态明显改善，提示GPD 具有促眠作用。

CRH、ACTH 和CORT 是HPA 轴重要的组成激素，与睡眠密切相关。当机体长期处于应激状态（如慢性睡眠剥夺）的情况下，会启动激素级联反应，使HPA 轴亢进，损伤脑组织［5］。临床研究表明：在慢性失眠患者中，睡眠时间少于5 h 的患者，CORT 水平增加，总睡眠时间与CORT 成反比［6］。最新研究认为HPA 轴对睡眠的影响主要取决于CRH，激活HPA 轴能使ACTH 和CORT 的浓度增加，产生觉醒效应［7］。本实验结果表明模型组大鼠血清和下丘脑中CRH、ACTH 和CORT 含量均显著升高，提示大鼠经慢性睡眠剥夺后，HPA 轴功能亢进。经GPD治疗后，血清和下丘脑中CRH、ACTH 和CORT 含量显著降低，可推测GPD 可通过降低CRH、ACTH 和CORT 含量，负反馈调节HPA 轴而促睡眠，且以中剂量GPD 效果较优。

此外，HPA 轴还受到多种神经递质的调控，如5-HT、NE、DA 等。5-HT 能神经元可以直接支配下丘脑室旁核分泌CRH，CRH 的释放又受到5-HT受体的调控，影响HPA 轴功能；同时CRH、ACTH 和CORT 又能抑制5-HT 能神经元细胞的活性，二者之间存在复杂的相互作用［8］。MENON 等［9］使用微透析技术证明单胺递质及其代谢产物在不同时长的睡眠剥夺期间发挥着重要作用。本实验通过HPLC 法检测5-HT、5-HIAA、NE 和DA 含量，结果表明模型组5-HT 和5-HIAA 明显下降，NE 和DA明显升高。GPD 治疗后能明显升高5-HT 和5-HIAA 含量，降低NE 和DA 含量，提示GPD 能通过升高5-HT、5-HIAA 含量，降低NE、DA 含量而治疗失眠，且以中剂量GPD 效果最佳。

综上，GPD 能改善慢性睡眠剥夺大鼠一般状态，调节5-HT、5-HIAA、NE 和DA 含量，降低CRH、ACTH 和CORT 含量，负反馈调节HPA 轴，改善HPA轴功能亢进状态，从而治疗慢性失眠。然而，本实验因时间、技术有限，未对慢性睡眠剥夺大鼠的睡眠时相、脑电波特征进行监测，这值得今后深入研究，为GPD 的临床使用提供科学依据。