基于网络药理学探究心舒宝片治疗心肌梗死的作用机制及实验验证

王世聪

（片仔癀药业股份有限公司，福建 漳州 363000）

心肌梗死（简称心梗）临床定义为长期缺血导致的心肌细胞死亡，患者具有高病死亡率和高残疾率的特点［1-4］。心梗导致心脏收缩功能受损、心肌肥大、纤维化和自噬活动改变，最终导致左心室功能的障碍［2］，临床常使用抗血栓药物、冠状动脉介入或搭桥手术对其进行治疗［3-4］。中医疗法能多途径降低心梗后的心肌损伤，调节情绪，减轻痛苦，提高生活质量，同时对心梗有预防作用，降低急性心梗的发病率［5］。心舒宝片由丹参、白芍、刺五加、郁金、山楂组成，具有活血化瘀、益气止痛的功效，临床常用于治疗冠心病、心绞痛、高血压等心血管疾病［6］，但对心梗的治疗报道较少。网络药理学是中药治疗机制研究的重要工具之一，能够揭示药物、疾病、靶点与通路之间的复杂关系［7-8］。为此，本研究通过网络药理学筛选心舒宝片治疗心梗的活性成分及有效作用靶点，对心舒宝片干预心梗的潜在机制进行探讨，并应用动物模型来验证潜在靶点，为心舒宝片临床新应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 心舒宝片活性成分与作用靶点的获取 基于中医药系统药理学平台（TCMSP）［9］和本草组鉴平台HERB平台［10］，通过口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 筛选心舒宝的组成中药（丹参、白芍、刺五加、郁金、山楂）的活性成分，构建心舒宝片活性成分数据 库。通 过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库对活性成分验证并转化为标准的Canonical SMILES 格式，随后导入Swiss Target Prediction 数据库预测药物作用靶点。

1.2 疾病靶点和有效作用靶点的收集 利用Dis-GeNET、DrugBank 数据库平台，以“Myocardial infarction”为关键词收集心梗的疾病靶点，构建心梗疾病靶点数据库。利用Venny 2.0 数据库（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获取药物作用靶点与心梗疾病靶点的交集，作为心舒宝片治疗心梗的有效作用靶点。

1.3 网络的构建与分析 将心舒宝片治疗心梗的有效作用靶点分别输入STRING11.0 数据库平台，设置物种为“H.sapiens”，并导入Cytoscape 3.6.0 软件，运用Network Analyzer 功能分析，筛选紧密度（closeness）和中介数（betweenness）大于中位数，度值（degree）大于各节点中位数3 倍的靶点为核心作用靶点。绘制心舒宝片与心梗有效作用靶点的相互作用（PPI）网络，并对PPI 网络进行分析。

1.4 KEGG 富集分析 将心舒宝片治疗心梗的有效作用靶点放入Metascape 平台（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），提交后将输入物种和分析物种选择为“H.sapiens”，设置P＜0.01，对有效作用靶点进行KEGG 富集分析，按照聚类结果进行排序，筛选P值排名靠前的20 条通路，进行结果可视化。

1.5 “中药-活性成分-有效作用靶点-通路”网络可视化 将心舒宝的中药、活性成分、有效作用靶点及通路4 个方面作为节点，建立彼此对应关系，导入Cytoscape 3.6.0 软件，构建“中药-活性成分-有效作用靶点-通路”网络，进行可视化展示。

1.6 实验验证

1.6.1 实验动物 雄性C57BL/6J 小鼠60 只，6～8周龄，体质量21～25 g，由斯贝福生物技术有限公司提供，动物合格证为SCXK（京）2019-0010，在温度（25±2）℃、湿度（60±5）%、12/12 h 昼/夜循环的环境下，适应性饲养3～5 d。

1.6.2 药品及试剂 心舒宝片（漳州片仔癀药业股份有限公司，产品批号：2011024）；TTC 试剂（北京西浓科技有限公司）。

1.6.3 仪器 Vevo770 高分辨率小动物超声心动检测系统（加拿大Visual Sonics 公司）。

1.6.4 心舒宝片的制备 实验所用的心舒宝片为黄棕色片剂，研钵研成粉末，使用蒸馏水进行配置，以10、20、40 mL 蒸馏水分别溶解1 片心舒宝片，得到52、26、13 mg/mL 心舒宝片溶液。

1.6.5 小鼠心梗模型的制备 采用随机数字表法将C57BL/6J 小鼠分为假手术组8 只和造模组52 只。使用1%戊巴比妥钠按0.1 mL/20 g 体质量麻醉小鼠，造模组采用行左前降支冠脉结扎方法制备心梗模型，假手术组则采用同法手术但不结扎冠状动脉。

1.6.6 分组与给药 造模成功后将造模组随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各13 只。各组均按0.1 mL/10 g 体质量灌胃，低、中、高剂量组分别以13、26、52 mg/mL 心舒宝片溶液（相当于临床人日用量的1/2、1、2 倍），假手术组及模型组以蒸馏水，术后第2 天灌胃，每日1 次，连续干预4 周。

1.6.7 心脏超声心动图检测 采用小动物超声心动检测系统检测各组小鼠的心功能指标，包括收缩末期左室内径（LVIDS）、舒张末期左室内径（LVIDD）、计算射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）。

1.6.8 心肌梗死面积的测定 干预4 周后，使用1%戊巴比妥钠按0.1 mL/20 g 体质量麻醉小鼠，取出心脏组织，置于生理盐水中，冲洗除去多余的血液，用滤纸吸干液体后，置于冰箱-20℃冷冻约10～15 min 后，将心脏切成厚度为1 mm 左右的薄片若干，经TTC 溶液染色后［11］，进行扫描拍照。

1.6.9 qPCR 实验 qPCR 检测血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF1a）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）的表达，收集“1.6.8”项中小鼠心脏组织，Trizol 提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书制备cDNA 后，以SYBRGreen 荧光染料试剂盒和PCR 仪器进行实时荧光定量PCR 扩增。用2-△△ct法测定目的基因相对表达量［12］。

1.6.10 统计学方法 实验数据采用IBM SPSS Statistics 21.0 统计软件进行分析，计量资料符合正态分布，采用单因素方差分析。方差齐时，两两比较采用LSD 法；方差不齐，则采用秩和检验。使用GraphPad Prism 6.0 进行统计数据的图形绘制。

2 结 果

2.1 心舒宝活性成分和作用靶点 通过TCMSP 和HERB 数据库收集，经OB 和DL 值筛选，得到活性成分97 个，其中丹参65 个，白芍13 个，郁金15 个，山楂6 个，刺五加3 个。根据OB 值排序前5 的活性成分信息见表1。药物的作用靶点共1 481 个，去重后剩747 个，平均每个活性成分对应7.70（747/97）个靶点，说明心舒宝片是通过多成分、多靶点发挥整体治疗作用的，心舒宝片的活性成分与作用靶点数量见表2。

表1 心舒宝片活性成分筛选列表（仅列每位药材OB 值排名前5 的活性成分）

表2 心舒宝片的中药活性成分与作用靶点数量

2.2 蛋白互作（PPI）网络分析 心梗涉及1 837 个靶点，心舒宝片作用靶点与心梗疾病靶点的交集为307 个有效作用靶点。心舒宝片治疗心梗的有效作用靶点涉及TNF、AKT1、VEGFA、IL1B、EGFR、MAPK3、STAT3、HIF1A、CASP3、HSP90AA1 等29 个核心作用靶点，见图1 和图2。图中节点越大，靶点度值越大，说明该靶点在治疗心梗的作用可能越重要。

图1 心舒宝片治疗心梗的有效作用靶点PPI 网络

2.3 KEGG 富集分析 有效作用靶点富集到131条KEGG 通路，其中包括花生四烯酸代谢、NF-κB信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、动脉粥样硬化等。列出P值排名前20 条的信号通路作为KEGG 图进行展示，见图2。

图2 KEGG 富集分析结果（前20 名）

2.4 “中药-活性成分-有效作用靶点-通路”网络可视化 构建“中药-活性成分-有效作用靶点-通路”的网络模型，显示该网络涉及5 个中药，67 个化学成分，109 个靶点，7 条通路，成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等，靶点有AKT1、BCL2L1、EGFR、PIK3CA、MAPK1、MAPK3、CASP3、IL1B 等，涉及MAPK 信号通路、NF-κB 信号通路等，见图3。图3 显示：同一活性成分对应多个靶点，多个靶点对应同一通路，体现了心舒宝片的多成分、多靶点、多通路的作用特点。

图3 “中药-活性成分-有效作用靶点-通路”网络可视化展示图

2.5 实验验证

2.5.1 模型小鼠心功能指标与心肌梗死面积比较 与假手术组比较，模型组小鼠EF和FS下降（P＜0.01），LVIDS 和LVIDD 均增加（P＜0.01）；与模型组比较，高剂量组EF 和FS 升高（P＜0.05），低剂量组FS 升高（P＜0.05），各给药组LVIDS 和LVIDD 均有下降趋势，但无统计学意义（P＞0.05），见图4。同时，与假手术组比较，模型组梗死面积明显增大，表明心梗模型造模成功；与模型组比较，各给药组心肌梗死面积缩小，表明心舒宝片能改善心肌损伤，减少心肌梗死面积。

图4 心舒宝片对各组小鼠心功能指标的影响

2.5.2 qPCR 验证 随机选取心舒宝作用的核心作用靶点和通路中的关键节点分子VEGFA、TNF1a、AKT1、MAPK3，分别对各组小鼠心脏组织进行mRNA的提取qPCR 的表达趋势的验证。引物设计和合成参见表3，表达趋势的结果见图5。通过qPCR 验证，心舒宝片给药后VEGFA、TNF1a、AKT1、MAPK3经One ANOVA 统计学分析均出现回调趋势，证明了预测靶点的稳定和可靠性。

图5 qPCR 验证各组小鼠4 个靶点的表达趋势图

表3 筛选靶点qPCR 验证的引物设计与合成

3 讨 论

心血管疾病是中老年的常见病和多发病，而心梗是最主要的疾病之一［13］。本研究主要探讨心舒宝片的作用机制，心舒宝片中的丹参、山楂、郁金、刺五加、白芍均具有心肌保护作用［14］：丹参活血化瘀，扩张冠状动脉，抑制血栓形成，参与心肌修复，丹参酮ⅡA 可改善血瘀型大鼠急性心梗后的心功能［15-17］；山楂有机酸有抗心律失常、降血压及调节脂质代谢等作用［18］；郁金能提高心肌组织的耐缺氧能力［19］；刺五加能抑制急性心梗大鼠的心室重构，抑制心肌细胞凋亡［20］，刺五加叶皂苷可增强抗氧化酶活性，减少自由基对心肌的氧化损伤，对急性心肌缺血发挥保护作用［21］；白芍能改善心肌缺血大鼠组织中抗氧化酶的活性，抑制炎症反应［22］，白芍总苷能抑制Wnt3a 表达，影响Wnt/βcatenin信号通路，从而保护性抑制心肌细胞凋亡［23］。心舒宝治疗心肌梗死的疗效可能源于其成分的潜在作用。

本研究结果表明VEGFA、AKT1、TNF、MAPK3、STAT3、CASP3、IL1B、MMP9 等靶点可能在心舒宝片治疗心梗的过程中发挥重要作用［24］。当心肌缺血时，激活炎性细胞释放TNF-α 及IL-6 等因子，增强炎症细胞的聚集与浸润［25］。CASP3 在细胞凋亡蛋白酶级联反应中处于重要地位［26］。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）能激活STAT3 来增加心肌梗死边界区内皮细胞数量并诱导心肌中血管内皮生成因子（VEGF）的表达，促进血管生成，抑制心肌细胞凋亡，有利于心梗后心肌重塑［27-28］。基质金属蛋白酶家族（MMPs）在促进动脉粥样硬化斑块与血栓形成中发挥重要作用［29］，MMP-9 加速形成不稳定型斑块，参与心脏基质的降解，加快心室重塑［30］。血清中MMP-9 可作为评估急性心梗后心律失常的标志物［31］。

心肌梗死的病理进程中免疫失调及炎症反应增加是其关键特征之一［32］。NF-κB 是急性心梗期间心脏组织中的炎性因子［33］，NF-κBp65 是NF-κB的主要反式激活转录激活因子，可激活TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎细胞因子［34］。TNF-α 能激活非钙离子依赖PLA2（iPLA2）而引起花生四烯酸释放并引起缺血后心动过速，在心肌纤维化的发病过程中，花生四烯酸代谢作为其潜在研究通路，发挥着重要的作用［35］。MAPKs 信号通路能介导细胞增殖、分化、凋亡等，参与了多种心血管疾病的发生、发展过程［36］。本研究结果显示心舒宝片可能通过调控NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路、花生四烯酸代谢、Ras 信号通路、cAMP 信号通路等发挥着多途径治疗心梗的作用。

综上，本研究采用网络药理学和实验验证相结合的方式，对心舒宝片治疗心梗的潜在靶点及通路进行分析和验证，系统阐释了心舒宝片治疗心梗可能的作用机制，为心舒宝片的临床价值定位和应用提供了新的依据和参考。