单宁酶处理改善夏秋季绿茶滋味品质

吴荣梅 余书平 余秀宏 汪永奇 曹青青 唐平 尹军峰 许勇泉

摘要：夏秋茶鲜叶原料中酯型儿茶素含量丰富，经传统方法加工而成的绿茶苦涩味重，不被广大消费者所接受，导致经济效益低，因而被广泛弃采并造成严重资源浪费。单宁酶是一种作用于没食子酰基的生物酶，可催化酯型儿茶素生成非酯型儿茶素与没食子酸，改变绿茶儿茶素组成，从而达到改善滋味品质的目的。文章在绿茶加工过程中添加单宁酶处理杀青叶，并分析了酶添加量与处理温度对成品绿茶浸提液感官品质与理化指标的影响。研究表明，单宁酶处理杀青叶可有效改善夏秋季绿茶浸提液滋味品质。随着酶添加量的提高，浸提液外观色泽越发清亮，苦涩味降低而回甘显著增强，整体口感得到极大改善。此外，酶解处理后，浸提液中的总儿茶素含量虽无明显变化，但酯型儿茶素含量与比例均显著降低，浸提液抗氧化活性得以提升。处理温度的影响虽不及酶添加量，但40 ℃处理的浸提液品质显著最佳。

关键词：单宁酶;夏秋季绿茶;感官品质;理化指标

Improving the Taste of Summer-Autumn

Green Tea with Tannase

WU Rongmei1， YU Shuping1， YU Xiuhong1， WANG Yongqi1， CAO Qingqing2*，

TANG Ping3， YIN Junfeng2， XU Yongquan2

1. Tea Science Research Institute of Kaihua County， Quzhou 324300， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Hangzhou Vocational & Technical College， Hangzhou 310018， China

Abstract： The fresh tea leaves in summer and autumn are rich in galloylated catechins and the green tea processed from those with the traditional technology is known as summer-autumn green tea. Summer-autumn green tea is bitter and astringent， which is not acceptable by most tea consumers. Thus， tea leaves in summer and autumn are widely discarded， which directly resulted in a serious waste of tea resource. Tannase is a type of biological enzyme acting on galloyl group specifically. It's able to catalyze galloylated catechins to generate non-galloylated catechins and gallic acid， and change the catechins' composition， leading to the improvement of tea taste. This study treated enzyme-denatured leaves with tannse during green tea processing， and analyzed the effects of tannase addition and treatment temperature on the sensory quality and physicochemical properties of summer-autumn green tea extract. The results show that tannase treatment could promote the overall quality of green tea extract. With the addition amount of tannase increased， the color of extract was lighter and clearer， bitterness and astringency were weakened， and sweet aftertaste and overall flavor got improved. Besides， the total catechins were not changed greatly.The contents and proportion of galloylated catechins dropped dramatically， and antioxidant activity increased. Treatment temperature had a less influence， but the overall quality of green tea extract under 40 ℃ was significantly the best.

Keywords： tannase， summer-autumn green tea， sensory quality， physicochemical property

單宁酯酰水解酶（Tannase，EC 3.1.1.20），简称单宁酶或鞣酸酶，是一种重要的生物技术酶，可催化没食子单宁、复合单宁与没食子酸酯等化合物中酯键的水解，释放没食子酸[1-2]。单宁酶在速溶茶、啤酒、果汁与红酒等饮料生产中被广泛用作澄清剂，可有效改善饮料液体的外观色泽与储藏过程中产生的浑浊问题[3]。绿茶是我国占比最大的茶类，但长久以来，绝大部分商品茶原料都采用产量低、成本高的春季鲜叶，而产量约为春季2倍的夏秋茶鲜叶因苦涩味重被广泛弃采。这不仅直接造成了茶鲜叶资源的严重浪费，还极大限制了我国绿茶产业的可持续发展。攻克夏秋茶资源利用这一产业瓶颈的关键在于解决其鲜叶原料苦涩味重、滋味品质差的现实问题。前期研究表明，夏秋茶苦涩味强烈的主要原因在于其丰富的酯型儿茶素含量，因为酯型儿茶素是绿茶苦涩味的重要贡献者[4-5]。单宁酶可催化水解酯型儿茶素生成非酯型儿茶素与没食子酸，生成的非酯型儿茶素与没食子酸不仅滋味柔和，基本无苦无涩，还具有令人愉悦的回甘滋味特征，可有效改善夏秋季绿茶的滋味品质[6-7]。本研究在此基础之上，尝试在夏秋季绿茶加工过程中添加单宁酶处理杀青叶以期达到改善其滋味品质的目的。研究重点分析了单宁酶添加量与处理温度对成品绿茶浸提液感官品质与理化指标的影响，研究结果可以为生产实践提供一定理论指导，对促进夏秋茶鲜叶原料的高效高值化利用具有积极意义。

1  材料与方法

1.1  试验材料与仪器

鲜叶原料：鸠坑种，一芽三叶，采摘于2019年9月浙江开化。

仪器：电磁杀青机、碧螺春烘干机;25型揉捻机;Flukef59红外线测温枪（美国福禄克公司）;岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

试剂：单宁酶（500 U/g，北京卫诺恩生物技术有限公司）;儿茶素（C）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸（GA）、谷氨酸、福林酚、乙腈（色谱纯）、过硫酸钾（K2S2O8）、2，2-二苯基-1-吡啶并肼基（DPPH）、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）等均购自Sigma-Aldrich;乙酸（色谱纯）、甲醇、氯化亚锡二水合物（SnCl2 ·2H2O）购自Aladdin;碳酸钠（Na2CO3）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）购自Macklin;茚三酮购自Alfa Aesar。

1.2  试验方法

1.2.1  样品制备

单宁酶酶解绿茶样品制备：采摘的鲜叶摊放过夜（约12 h，含水率74.84%），240 ℃下杀青1 min（电磁杀青机），用25型揉捻机揉捻30 min至出汁，喷洒不同浓度单宁酶溶液后再揉捻15 min。完全混合后，揉捻叶置于不同温度下进行酶解处理，最后采用烘干机在90～120 ℃下烘至足干。单宁酶添加量分别为杀青叶（含水量50%，水浸出物50%）质量的0.05%、0.10%、0.25%、0.50%，处理温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃，以添加量0、处理温度30 ℃为对照。处理时间为揉捻后180 min。每个茶样2 kg，制样重复2次。

绿茶浸提液制备：5 g干茶，250 mL纯水，85 ℃水浴条件下浸提20 min，纱布过滤。浸提液冷却至室温（25 ℃± 2 ℃）后用于感官评价和理化指标的测定。

1.2.2  感官评价

采用“十点标度法”[6]定量评价绿茶浸提液的苦味、涩味、回甘等滋味强度，其中8～10分表示“非常强”，6～8分表示“较强”，4～6分表示“正好（一般）”，2～4分表示“较弱”，0～2分表示“非常弱”;整体风味的评分则基于评价员对上述3种滋味属性的综合反馈，同样采取10分制。所有样品感官评价由专业审评小组成员（5男4女，25～48岁）完成。

1.2.3  色差测定

绿茶浸提液的色差参数由色差仪（CM-3500d，柯尼卡美能达投资有限公司）测定[8]。色差结果采用CIE三度色彩空间（CIE L*a*b*）表示，其中，L*表示亮度，取值0（纯黑）到100（纯白）;a*表示红绿色度，正值（+）表示红色，负值（–）表示绿色;b*表示黄蓝色度，正值（+）表示黄色，负值（–）表示蓝色;C*则表示色彩饱和度，一定程度上可以综合反映a*/b*。

1.2.4  茶多酚与游离氨基酸含量测定

绿茶浸提液中的茶多酚含量采用福林酚法[9]测定。5 mL10%福林酚溶液加到1 mL浸提液样品（或没食子酸标品样品液、纯水）中，充分混合静置5 min后加入5 mL7.5%Na2CO3溶液，混合体系室温静置反应1 h，之后用紫外分光光度计于765 nm下测定吸光度。

游离氨基酸含量测定参考茚三酮法[10]。取1 mL浸提液样品（或谷氨酸标品样品液、纯水）置于25 mL容量瓶中，之后依次加入0.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.0）和2%茚三酮溶液，沸水浴15 min，冷却至室温，纯水定容，570 nm处测定吸光度。

1.2.5  儿茶素、没食子酸与咖啡碱测定

儿茶素、没食子酸与咖啡碱含量的测定利用岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）[7]。绿茶浸提液样品经0.45 μm微孔滤膜过滤后上样，液相方法如下：Diamonsil™ C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱温40 ℃，检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，流动相A为0.2%乙酸，B为纯乙腈。梯度洗脱，B相初始为6.5%，在16 min内由6.5%线性梯度变化到25%，30 min回到6.5%，平衡5 min。

1.2.6  抗氧化活性测定

绿茶浸提液的抗氧化活性采用DPPH法测定[11]。100 μL样品（或Trolox标准样品液、纯水）与3.9 mL DPPH反应液（6 × 10−5 mol/L，溶于甲醇）充分混合后室温避光孵育2 h，之后用紫外分光光度计测定515 nm处的吸光度。

1.2.7  数据处理与分析

所有试验数据均表示为3个重复的“平均值±标准差”（X ± SD），采用SAS 9.4软件进行单因素方差分析（ANOVA）、多重比较（Duncan，P < 0.05）以及相关性分析，采用SIMCA-P 14.1作主成分分析（PCA），采用GraphPad Prism 9.0作图。

2  结果与分析

2.1  单宁酶添加量与处理温度对绿茶浸提液感官品质的影响

不同酶解处理得到的绿茶浸提液外观色泽呈现出肉眼可见的差别（图1-A），随着单宁酶添加量的增加，浸提液颜色逐渐变亮变浅，而不同温度处理间的差异不易察觉。图1-B中的色差数据很好地佐证了视觉感知结果。单因素方差分析结果显示，浸提液的各色差指标均受到单宁酶添加量的显著影响（P < 0.01）。单宁酶浓度的提高导致绿茶浸提液色泽L*与a*值升高的同时，还会引起b*与C*值的降低。这说明，单宁酶酶解绿茶会有效改善其浸提液外觀色泽的亮度，并降低黄绿色度以及整体色彩饱和度。单宁酶添加量与色差指标之间也呈现良好相关性（P < 0.000 1;L*∶R = 0.690;a*∶R = 0.889;b*∶R =-0.837;C*∶R =-0.839）。这或许与单宁酶的澄清效果有关。Lu等[3]研究发现相较于未经酶处理的对照组，单宁酶处理组的绿茶茶汤具有更好的外观色泽，包括更高的澄清度与亮度、更少的沉淀物，因为单宁酶处理后的茶汤与蛋白的结合力更低，多羟基成分（主要是多酚）稳定性明显提高。杨晓丽[12]也发现添加单宁酶不仅可以显著减少绿茶浓缩液中浑浊物的生成，浓缩液颜色清亮，还能有效保障储存过程中的澄清度。此外，处理温度仅对a*值有一定影响（P < 0.01），30 ℃下的a*值显著低于40 ℃、50 ℃下的a*值，意即浸提液的绿色度更高。

不同酶解處理下的绿茶浸提液滋味属性也呈现显著差异。图2-A显示，绿茶加工过程中单宁酶处理可以显著降低（P < 0.001）其浸提液的苦涩味、增强回甘，从而达到改善整体风味的目的。酶添加量与苦味（P < 0.000 1，R = -0.765）、涩味（P < 0.01，R = -0.575）、回甘（P < 0.000 1，R = 0.741）以及整体风味（P  < 0.000 1，R = 0.724）之间均存在显著相关性。浸提液滋味属性也在一定程度上受酶解处理温度的影响，如图2-B所示。40 ℃下浸提液的苦涩味最低、回甘最强，整体风味最佳。不过，整体而言，处理温度对绿茶浸提液感官品质的影响远不及单宁酶添加量。总之，单宁酶酶解绿茶主要通过改善浸提液外观色泽、降低苦涩味与增强回甘达到改善整体感官品质的目的，这与前期研究结果一致[6-7]。

2.2  单宁酶添加量与处理温度对绿茶浸提液理化成分的影响

为进一步探索单宁酶酶解处理再加工叶改善绿茶浸提液的内在机制，各酶解处理组浸提液样品的主要成分被一一测定并分析，包括茶多酚、咖啡碱、氨基酸等。主成分分析结果的Biplot（图3）直观地反映了各处理组与各成分含量之间的复杂关系。从中可以看出，所有样品处理组按照其成分含量大致可以划分成两部分，分别位于Biplot的左右两侧，左侧是单宁酶低添加量处理组（酶添加量0～0.10%），右侧则是高添加量处理组（0.25%～0.50%）。其中，对照组（CK）位于最左侧，虽与低添加量处理组较为接近，但依然具有良好的区分度，说明酶解处理确实对绿茶浸提液的理化成分产生相当程度的影响。此外，左侧低添加量处理组（包括CK）与ECG、GCG、EGCG、CG、C、GC等儿茶素成分标记点相对集中，说明该组样品中含有大量这些成分;而高添加量处理组则含有更多的EC、EGC和GA，并具有更高的抗氧化活性。而茶多酚、咖啡碱和游离氨基酸三大主要成分似乎没有表现出与高或低添加量处理组间明显的离散性，说明其在这两大处理组间的含量差异并不显著。

重点分析酶添加量与处理温度对几种主要成分含量的影响发现，单宁酶处理浓度显著影响浸提液中的茶多酚（P < 0.05）与咖啡碱含量（P < 0.05），但并未呈现显著的相关关系（P > 0.05）（图4），氨基酸含量则不受单宁酶影响，在各处理组之间基本保持稳定。此外，这三大主要成分含量在不同温度处理组间均未呈现出显著差异。

儿茶素是绿茶中含量最高的多酚类物质，对绿茶风味与保健功能贡献斐然。图5-A、图5-B分别显示了单宁酶添加量与处理温度对浸提液中儿茶素组分的影响。结果表明，单宁酶添加量与温度的不同并不会导致浸提液中总儿茶素含量的变化（P > 0.05），但是酯型儿茶素与非酯型儿茶素的含量都发生了剧烈变化（图5-A）。随着单宁酶添加量的增加，绿茶浸提液中酯型儿茶素绝对含量与百分含量都显著下降（P < 0.000 1），而非酯型儿茶素与之相反。酶解处理温度也对儿茶素组分产生一定影响（图5-B），40 ℃处理的浸提液中酯型儿茶素含量与百分比均显著低于其他温度处理，这与前文中感官结果相吻合，证明在本研究中40 ℃是单宁酶酶解的最佳温度。前期研究表明，酯型儿茶素具有强烈苦涩味（尤其是EGCG），是导致夏秋季绿茶苦涩味重的关键原因[4];而非酯型儿茶素滋味柔和，具有明显回甘滋味特征[6];此外，没食子酸也被证明是绿茶茶汤关键回甘滋味化合物之一[7]。单宁酶处理绿茶杀青过程中，鲜叶中大量的酯型儿茶素被水解成非酯型儿茶素和没食子酸，儿茶素组分发生剧烈变化，成品茶滋味口感也从苦涩刺激向回甘醇和转化，使得整体风味得到明显改善。

此外，浸提液的抗氧化活性也受单宁酶添加量的影响（P < 0.000 1）。相关性分析结果显示，单宁酶添加量与浸提液抗氧化活性之间存在显著正相关（P < 0.001，R = 0.634）。这与Thiyonila等[13]的研究结果一致，该研究发现单宁酶具有提高绿茶浸提液抗氧化活性的潜力，因为单宁酶水解复杂多酚类化合物的酯键使得酚类抗氧化剂得以充分释放。

3  结论

单宁酶被广泛应用于食品饮料生产中，对改善饮料沉淀浑浊与风味都具有显著成效。本研究以夏秋茶鲜叶作为原料，在绿茶加工过程中添加单宁酶处理杀青叶，以期有效改善夏秋季绿茶苦涩味重的风味弊端。研究表明，单宁酶添加量与处理温度都会显著影响成品绿茶浸提液的感官品质与理化指标。随着酶添加量的增加，浸提液外观色泽亮度提升、色彩饱和度降低，苦涩味降低、回甘提高、整体风味显著得到改善;浸提液酯型儿茶素含量与比例显著降低，抗氧化活性提高。处理温度虽不及酶添加量的影响显著，但对浸提液的风味特征和理化成分依然具有较大影响，40 ℃被证明是最佳处理温度，该温度下浸提液中的酯型儿茶素含量与比例最低，整体口感最佳。

参考文献

[1] 王挥， 黄寿恩， 颜红， 等. 单宁酶制备研究进展[J]. 食品与机械， 2012， 28（3）： 246-254.

[2] YAO J， GUO G S， REN G H， et al. Production， characterization and applications of tannase[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2014， 101： 137-147.

[3] LU M J， CHU S C， YAN L， et al. Effect of tannase treatment on protein-tannin aggregation and sensory attributes of green tea infusion[J]. LWT - Food Science and Technology， 2009， 42： 338-342.

[4] XU Y Q， ZHANG Y N， CHEN J X， et al. Quantitative analyses of the bitterness and astringency of catechins from green tea[J]. Food Chemistry， 2018， 258：16-24.

[5] 张英娜， 陈根生， 刘阳， 等. 烘青绿茶苦涩味及其滋味贡献物质分析[J]. 茶叶科学， 2015， 35（4）： 377-383.

[6] ZHANG Y N， YIN J F， CHEN J X， et al. Improving the sweet aftertaste of green tea infusion with tannase[J]. Food Chemistry， 2016， 192： 470-476.

[7] CAO Q Q， ZOU C， ZHANG Y H， et al. Improving the taste of autumn green tea with tannase[J]. Food Chemistry， 2019， 277： 432-437.

[8] MAO Y L， WANG J Q， CHEN G S， et al. Effect of chemical composition of black tea infusion on the color of milky tea[J]. Food Research International， 2021， 139： 109945.

[9] SINGLETON V L， ORTHOFER R， LAMUELA-RAVENTóS R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology， 1999， 299（1）： 152-178.

[10] MAGNé C， LARHER F. High sugar content of extracts interferes with colorimetric determination of amino acids and free proline[J]. Analytical Biochemistry， 1992， 200（1）： 115-118.

[11] XU Y Q， YU P， ZHOU W. Combined effect of pH and temperature on the stability and antioxidant capacity of epigallocatechin gallate （EGCG） in aqueous system[J]. Journal of Food Engineering， 2019， 250： 46-54.

[12] 楊晓丽. 复合酶水解技术改善绿茶浓缩液品质的研究[J]. 中国茶叶加工， 2021（2）： 48-53.

[13] THIYONILA B， KANNAN M， PAULIN RN， et al. Influence of tannase from serratia marcescens strain IMBL5 on enhancing antioxidant properties of green tea[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology， 2020， 27： 101675-101684.