黄芩素调控miR-378a-5p对脂多糖诱导的心肌细胞损伤和凋亡的影响

韩福星 王高频（山东省烟台市毓璜顶医院心内科，烟台 264001）

脓毒症是重症监护病房的危重症，病死率高，严重影响患者的生活质量。在严重脓毒症患者中，多脏器功能障碍特别是心肌功能障碍经常发生。研究表明线粒体氧化应激、细胞凋亡、炎症反应是导致心肌组织结构、功能破坏的主要因素［1-2］。因此，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的药物对脓毒症心肌细胞损伤具有保护作用。黄芩素是中草药黄芩中的重要黄酮类化合物，研究表明黄芩素在亚急性期通过减少神经炎症和神经损伤能够改善缺血再灌注所致的脑损伤［3］。黄芩素还可能通过清除氧自由基保护大鼠心肌缺血损伤以及心肌细胞体外氧化损伤［4］。微小RNA（miRNAs）是一类长度为19～25个核苷酸的非编码RNA，其通过调节靶mRNA 的翻译或降解在脓毒症心肌病发生和进展中具有功能作用［5-6］。研究指出在心肌缺血再灌注损伤小鼠中miR-378a-5p 表达增加［7］。下调miR-378a-5p 表达还可减弱乙醇诱导的心肌细胞凋亡［8］。然而，黄芩素、miR-378a-5p 对脓毒症心肌细胞损伤的影响未见报道。本研究以脂多糖（lipopoly saccharide，LPS）诱导大鼠心肌细胞H9C2 建立脓毒症心肌细胞损伤模型［9］，旨在探讨黄芩素对LPS 诱导的H9C2 细胞损伤和凋亡的保护作用，并阐明其机制是否与调控miR-378a-5p表达有关。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞H9C2 购自中科院上海生物化学与细胞生物学研究所；黄芩素购自（批号111595-201808，纯度97.9%，采用二甲基亚砜溶液，使用前稀释至所需浓度）中国食品药品检定研究院；LPS购自北京博蕾德生物科技公司；miR-378a-5p模拟物（mimics）及其对照品（miR-con）购自上海吉玛制药公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自北京百奥莱博公司；乳酸盐脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒、TNF-α、IL-6 检测试剂盒购自北京索莱宝生物公司；羊抗兔IgG 二抗购自上海碧云天生物公司；兔抗鼠细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（p21）、B 细胞淋巴瘤（Bcl-2）、Bcl 相关x 蛋白（Bax）、β 肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体购自中国Abcam 公司；miRNA 提取试剂盒、miRNA 逆转录试剂盒、miRNA 荧光定量PCR 试剂盒购自南京诺唯赞生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、模型构建 DMEM 培养基复苏H9C2 细胞，置于含5%CO2、37℃湿润培养箱中培养。细胞融合度为80%时按照1∶3 比例传代培养。参照文献［9］采用LPS 终浓度为含1µg/ml的培养液孵育H9C2细胞24 h建立脓毒症心肌细胞损伤模型。

1.2.2 转染和实验分组 将对数期H9C2 细胞接种6 孔板，细胞融合度为60%按照Lipofectamine 2000 说明书将miR-378a-5p mimics、miR-con 分别转染至H9C2 细胞，转染48 h 后实时定量PCR 检测转染效果。未进行处理的H9C2 记为对照（Con）组；LPS 组参照上述建模方法；用含10、20、40 µmol/L黄芩素的培养液分别孵育H9C2 细胞24 h，再用含1µg/ml LPS 的培养液孵育细胞24 h 依次记为LPS+10µmol/L黄芩素组、LPS+20µmol/L黄芩素组、LPS+40µmol/L 黄芩素组。用含20µmol/L 黄芩素的培养液孵育转染miR-con、转染miR-378a-5p mimics 的H9C2细胞24 h，再用含1µg/ml LPS的培养液孵育细胞24 h 依次记为LPS+20 µmol/L 黄芩素+miR-con组、LPS+20µmol/L黄芩素+miR-378a-5p组。

1.2.3 CCK-8 法测定细胞活力 将转染或未转染H9C2 细胞接种96 孔板，按照1.2.2 分组方法给予LPS 和/或黄芩素处理，结束后更换为新鲜培养液，各孔中加入10 µl CCK-8 溶液继续培养2.5 h，使用酶标仪分析各孔在450 nm 处光密度值以表示细胞活力。细胞存活率（%）=实验组OD 值/对照组OD值×100%

1.2.4 流式细胞术检测凋亡 磷酸盐缓冲液洗涤各组H9C2 细胞2 次，用1×结合缓冲液调整密度为2×105个/ml的单细胞悬液。取500µl细胞悬液至流式管，分别加入10 µl 的Annexin V-FITC、5 µl 的PI进行暗室染色15 min。1 h 内采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.5 试剂盒检测MDA、TNF-α 和IL-6 水平以及LDH、SOD 和GSH-Px 活性 细胞按照1.2.2 分组进行处理后，分别收集上清液和细胞。按照LDH、TNF-α、IL-6 检测试剂盒说明书测定LDH 释放量以及TNF-α、IL-6 分泌量。加入提取液，超声破碎细胞并收集上清液，参照MDA、SOD 和GSH-Px 检测试剂盒测定MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.2.6 Western blot分析CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达 用RIPA 缓冲液从H9C2 细胞中提取总蛋白。取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后转移到硝酸纤维素膜。室温下，膜采用5%脱脂牛奶封闭1 h 后，再用1∶1 000 稀释的一抗溶液孵育膜2 h，随后用1∶1 500 稀释的二抗溶液孵育膜1 h。加入增强化学发光试剂进行显色反应，Image J软件分析各条带灰度值，目的蛋白表达量以对应蛋白和内参β-actin灰度值比值表示。

1.2.7 实时定量PCR 检测miR-378a-5p 表达miRNA 提取试剂盒分离细胞中总RNA，再用miRNA逆转录试剂盒、miRNA qPCR Mix 进行反转录、实时定 量PCR 反应，2-ΔΔCt法分析miR-378a-5p 表达量。miR-378a-5p 正向引物5'-CTCCTGACTCCAGGTCCTGT-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTGGGGA-3'；内参基因U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计分析。所有实验独立重复3 次，实验数据符合正态分布以表示。使用单向方差分析和SNK-q检验分析多组间差异，独立样本t检验分析两组间差异。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素对LPS处理的H9C2细胞增殖和凋亡的影响 与Con 组比较，LPS 组H9C2 细胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达量、细胞存活率显著降低，而p21 和Bax 蛋白表达量、凋亡率显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+10 µmol/L 黄芩素组、LPS+20 µmol/L黄芩素组、LPS+40 µmol/L 黄芩素组H9C2 细 胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达量、细胞存活率显著升高，而p21 和Bax 蛋白表达量、凋亡率显著降低（P＜0.05）。且LPS+10µmol/L 黄芩素组、LPS+20µmol/L黄芩素组、LPS+40µmol/L 黄芩素组3 组间上述指标比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1和图1。

图1 黄芩素对LPS处理的H9C2细胞增殖、凋亡的影响Fig.1 Effects of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 treated with LPS

表1 黄芩素对LPS处理的H9C2细胞增殖、凋亡的影响（，n=3）Tab.1 Effects of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表1 黄芩素对LPS处理的H9C2细胞增殖、凋亡的影响（，n=3）Tab.1 Effects of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS +10 µmol/L baicalein group，3）P＜0.05；compared with LPS+20µmol/L baicalein group，4）P＜0.05.

2.2 黄芩素对LPS 处理的H9C2 细胞氧化应激及炎症因子分泌的影响 与Con 组比较，LPS 组H9C2细胞MDA 水平、LDH 释放量、TNF-α 和IL-6 分泌量显著升高，SOD 和GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+10 µmol/L 黄芩素组、LPS+20µmol/L 黄芩素组、LPS+40µmol/L 黄芩素组H9C2细胞MDA 水平、LDH 释放量、TNF-α 和IL-6 分泌量显著降低，SOD 和GSH-Px 活性显著升高（P＜0.05）。且LPS+10µmol/L 黄芩素组、LPS+20µmol/L 黄芩素组、LPS+40µmol/L 黄芩素组3 组间上述指标比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 黄芩素对LPS处理的H9C2细胞氧化应激及炎症因子分泌的影响（，n=3）Tab.2 Effects of baicalein on oxidative stress and inflammatory factor secretion in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表2 黄芩素对LPS处理的H9C2细胞氧化应激及炎症因子分泌的影响（，n=3）Tab.2 Effects of baicalein on oxidative stress and inflammatory factor secretion in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS +10 µmol/L baicalein group，3）P＜0.05；compared with LPS+20µmol/L baicalein group，4）P＜0.05.

2.3 黄芩素对LPS 处理的H9C2 中miR-378a-5p 表达的影响 与Con 组比较，LPS 组H9C2 细胞miR-378a-5p 表达量显著升高（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+10µmol/L黄芩素组、LPS+20µmol/L黄芩素组、LPS+40 µmol/L 黄芩素组H9C2 细胞miR-378a-5p表达量显著降低（P＜0.05）。且LPS+10µmol/L 黄芩素组、LPS+20 µmol/L 黄芩素组、LPS+40 µmol/L 黄芩素组3 组间上述指标比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 黄芩素对LPS 处理的H9C2 中miR-378a-5p 表达的影响（，n=3）Tab.3 Effects of baicalein on expression of miR-378a-5p in H9C2 treated with LPS（，n=3）

表3 黄芩素对LPS 处理的H9C2 中miR-378a-5p 表达的影响（，n=3）Tab.3 Effects of baicalein on expression of miR-378a-5p in H9C2 treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS+10 µmol/L baicalein group，3）P＜0.05；compared with LPS+20 µmol/L baicalein group，4）P＜0.05.

2.4 过表达miR-378a-5p 效率检测 miR-378a-5p组H9C2 细胞中miR-378a-5p 表达量较miR-con 组显著升高（P＜0.05，表4）。

表4 过表达miR-378a-5p效率检测（，n=3）Tab.4 Detection of efficiency of overexpression of miR-378a-5p（，n=3）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05.

2.5 过表达miR-378a-5p逆转黄芩素对LPS处理的H9C2 细胞增殖和凋亡的影响 与LPS+20 µmol/L黄芩素组、LPS+20µmol/L 黄芩素+miR-con 组比较，LPS+20 µmol/L 黄芩素+miR-378a-5p 组H9C2 细 胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达量、细胞存活率显著降低，而p21 和Bax 蛋白表达量、凋亡率显著升高（P＜0.05）。见图2和表5。

表5 过表达miR-378a-5p逆转黄芩素对LPS处理的H9C2细胞增殖和凋亡的影响（，n=3）Tab.5 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表5 过表达miR-378a-5p逆转黄芩素对LPS处理的H9C2细胞增殖和凋亡的影响（，n=3）Tab.5 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on proliferation and apoptosis of H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with LPS+20µmol/L baicalein group，1）P＜0.05；compared with LPS+20µmol/L baicalein+miR-con group，2）P＜0.05.

图2 过表达miR-378a-5p 可以逆转黄芩素（20 μmol/L）对LPS处理的H9C2中增殖、凋亡的影响Fig.2 Overexpression of miR-378a-5p can reverse effect of baicalein（20 μmol/L）on proliferation and apoptosis of H9C2 treated with LPS

2.6 过表达miR-378a-5p逆转黄芩素对LPS处理的H9C2 细胞氧化应激和炎症因子分泌的影响 与LPS+20 µmol/L 黄芩素组、LPS+20 µmol/L 黄芩素+miR-con组比较，LPS+20µmol/L黄芩素+miR-378a-5p组H9C2 细胞MDA 水平、LDH 释放量、TNF-α 和IL-6分泌量显著升高，SOD 和GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05，表6）。

表6 过表达miR-378a-5p逆转黄芩素对LPS处理的H9C2细胞氧化应激和炎症因子分泌的影响（，n=3）Tab.6 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on oxidative response and secretion of inflammatory factors in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

表6 过表达miR-378a-5p逆转黄芩素对LPS处理的H9C2细胞氧化应激和炎症因子分泌的影响（，n=3）Tab.6 Overexpression of miR-378a-5p reverses effect of baicalein on oxidative response and secretion of inflammatory factors in H9C2 cells treated with LPS（，n=3）

Note：Compared with LPS+20µmol/L baicalein group，1）P＜0.05；compared with LPS+20µmol/L baicalein+miR-con group，2）P＜0.05.

3 讨论

黄芩素是黄芩的主要活性成分之一，其通过抗氧化、抗凋亡、抗炎、保护线粒体机制具有广泛的心脏保护作用。文献证实黄芩素通过抑制活性氧产生、钙离子超载保护心肌细胞免受溶血磷脂酰胆碱引起的细胞凋亡［10］。泛素E3 连接酶膜相关锌指蛋白5（MARCH5）在调节线粒体动力学和线粒体自噬方面起着关键作用，黄芩素还通过稳定细胞中MARCH5 表达能够减轻心肌细胞凋亡和氧化损伤［11］。TNF-α和IL-6是参与炎症启动和调节的促炎细胞因子，本研究发现LPS处理H9C2细胞后TNF-α和IL-6 分泌量显著增加，而黄芩素处理显著抑制LPS 诱导的TNF-α 和IL-6 分泌，这与CHEN 等［12］报道黄芩素的抗炎作用一致。此外，黄芩素对气道损伤、肝损伤均表现出抗炎作用［13-14］。LDH 是细胞质中的特异性心肌酶，当细胞损伤时释放到细胞外，通过检测LDH 水平可有效地反映心肌细胞损伤程度［15］。进一步分析发现黄芩素处理显著增加LPS诱导的H9C2细胞的活力，减少细胞凋亡，抑制LDH 释放，抑制脂质过氧化产物MDA 产生，并提高抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性。此外，本研究发现黄芩素处理显著增加促增殖蛋白CyclinD1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达量，降低增殖抑制蛋白p21、凋亡促进蛋白Bax 的表达量，这与黄芩素的促增殖、抗凋亡作用吻合。以上研究表明黄芩素可保护H9C2 细胞免受LPS诱导的炎症、氧化损伤和凋亡。

多项研究证实黄芩素通过调控miRNA 表达进而发挥抗肿瘤、抗纤维化作用［16-17］。例如黄芩素通过下调miR-183 表达抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭［18］；黄芩素还通过调控miR-21表达抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生进而抑制瘢痕形成［19］。miRNA 的表达失调已被证实与心脏发育、心肌损伤等生理病理过程相关，但黄芩素是否通过调控miRNA 表达发挥心肌保护作用未见报道［20］。本研究中LPS 处理后H9C2 细胞中黄芩素miR-378a-5p表达量显著增加，而黄芩素处理显著降低受损H9C2 细胞中miR-378a-5p 表达水平，提示黄芩素的心肌保护作用可能与调控miR-378a-5p 表达有关。深入研究显示，转染miR-378a-5p mimics 上调miR-378a-5p表达显著减弱黄芩素对LPS诱导下H9C2细胞活力、凋亡、炎症反应以及氧化损伤的影响，说明黄芩素可能通过下调miR-378a-5p 进而保护H9C2细胞免受LPS诱导的炎症、氧化损伤和凋亡。

综上所述，本研究证实黄芩素可减轻LPS 诱导的心肌细胞凋亡、炎症反应和氧化损伤，其机制可能与下调受损心肌细胞miR-378a-5p表达有关，这开发黄芩素用于脓毒症心肌病治疗提供了理论依据。