正交试验法优选痔瘘凝胶的提取工艺

潘冬梅 郦 帅 洪顺福 陈海红 刘晓昱 何飞燕 陈红梅

痔在临床上是最常见的肛肠疾病，发病率占所有肛肠疾病的87.2%，主要表现为疼痛、便血、脱出、局部分泌物增多和排便困难等[1-2]。杭州市中医院院内制剂“痔瘘洗剂”[3]，由黄连、大黄、马齿苋、苍术、蒲公英、芒硝、明矾七味中药材组成，在临床上使用20余年，疗效确切，主治湿热、热毒性痔疮、肛裂。方中黄连、大黄清热除湿、泻下攻积，为君药。马齿苋清热凉血消肿、苍术燥湿祛风散寒，为臣药。蒲公英利尿通淋、清热散结，明矾燥湿止痒，芒硝清火消肿，为佐药。但本品是玻璃瓶装洗剂（规格为250mL/瓶），携带使用不便，现笔者将其剂型进行改进，制成外用凝胶。凝胶剂主要作用于皮肤、口腔、眼、鼻、阴道、直肠等，具有缓释、控释等功效[4]。本处方中药材所含有效成分主要为有机酸、黄酮、生物碱、挥发油、萜类等，复方制剂的成分相对复杂，笔者选用乙醇为提取溶剂，对痔瘘洗剂处方药材进行提取浓缩，制得流浸膏，并以小檗碱、大黄酸、大黄素的提取量和浸膏得率为考察指标，采用正交试验法优选最佳提取工艺条件，为该制剂的实际生产提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪 器 Agilent 高效液相色谱仪（1220 CL System VL），德国IKA 数显型，RV10 旋转蒸发仪（上海人和仪器有限公司），梅特勒XS-105 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），KQ-500E 型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），RE.52AA 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），FW135粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2药材、药品及试剂 黄连（浙江钱王中药有限公司，批号202105040）、大黄（浙江钱王中药有限公司，批号202102009）、马齿苋（杭州华东中药饮片，批号20210617）、苍术（浙江佐力百草中药饮片有限公司，批号20210601）、蒲公英（浙江佐力百草中药饮片有限公司，批号20210501）、芒硝（浙江钱王中药有限公司，批号202101027）、明矾（杭州华东中药饮片，批号20210505）；杭州市中医院痔瘘洗剂（批号210527）；对照品：盐酸小檗碱（批号Y31J9H67024）、大黄酸（批号T30A8F42628）、大黄素（批号T02S8F42983），均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇（天津市四友精细化学品有限公司）为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1中药有效成分提取 将处方中各味中药粉碎过筛，于烘箱中50℃烘干。按照处方比例称取黄连、大黄、马齿苋等中药饮片各10g，置于提取罐中，按一定的料液比加入乙醇溶液，按正交试验条件进行提取，提取液真空抽滤，弃去固体残渣，滤液旋转蒸发浓缩并定容于100mL 量瓶中，共制得9 份提取液，备用。

2.2正交试验优选提取工艺 采用L9（34）设计正交试验，以小檗碱、大黄酸、大黄素的含量和出膏率为优选条件的指标，选取的四个因素分别是：乙醇浓度（%）、乙醇倍量（倍）、提取时间（h）、提取次数（次），各3 个水平，重复3 次，采用正交试验法选取最佳提取工艺，见表1。

表1 正交试验因素与水平

2.3出膏率测定[5]精密吸取上述提取液各20mL，分别置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h；移至干燥器中，冷却30min，迅速精密称定质量，计算出膏率：出膏率＝[干膏质量（g）/药材总质量（g）]×100%。

2.4小檗碱、大黄酸、大黄素测定

2.4.1色谱条件[6-7]选用色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18 柱（4.6×150mm，5μm）；流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液（90∶10），流速1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温30℃；进样量5μL。在该色谱条件下，样品分离好。

2.4.2标准品对照溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品适量，加甲醇分别制成每1mL 含盐酸小檗碱91.20μg、大黄酸36.69μg、大黄素203.2μg 的对照品储备液；再分别精密移取盐酸小檗碱储备液3mL、大黄酸储备液12mL、大黄素储备液4mL，置25mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。见图1。

图1 对照品的图谱

2.4.3供试品溶液制备[8]精密称定样品流浸膏1.0005g，置具塞平底烧瓶中，加入10%的NaCl 10mL。用力振摇，使沉析，过滤得滤液，加8%盐酸溶液10mL，再加CHCl310mL，超声20min，用CHCl3，萃取（3 次，10mL 次），合并CHCl3液，减压回收溶剂至干，用甲醇定容至10mL，得供试样品溶液，备用。见图2。

图2 空白对照的图谱

2.4.4空白对照溶液制备 用缺黄连和大黄的中药材按“2.1”项提取，按“2.4.3”项制备。见图3。

图3 供试品的图谱

2.4.5线性关系考察 将混合对照品溶液，按“2.4.1”项的色谱条件和进样标准依次进样，记录保留时间和峰面积。对照品的峰面积作为纵坐标，对照品在溶液中的浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，拟合回归方程：盐酸小檗碱：y=81863x-184130，R2=0.9959，大黄酸y=43483x-44858，R2=0.9989，大黄素y=58220x-441964，R2=0.9987，表明小檗碱、大黄酸、大黄素具有良好的线性关系。

2.4.6精密度试验 取混合对照品某一适宜浓度的样品溶液，按“2.4.1”项的色谱条件和进样标准连续进样6 次，记录3 个标准品的保留时间和峰面积，计算三种成分的RSD 值。盐酸小檗碱峰面积的RSD 为0.83%，大黄酸峰面积的RSD 为0.88%，大黄素峰面积的RSD 为0.34%，该结果说明，仪器的精密度适宜用作实验分析。

2.4.7稳定性试验 取同一批供试品溶液，按“2.4.1”项色谱条件，分别在0、1、2、3、4、5、6h 进样，测定盐酸小檗碱、大黄酸和大黄素的峰面积，流浸膏的峰面积RSD 分别为1.07%、1.12%、1.73%，表明供试品在6h 内基本稳定。

2.4.8重复性试验 取同一批供试品溶液6 份，进样测定。结果显示，6 份供试品的盐酸小檗碱峰面积的RSD 为1.09%，大黄酸峰面积的RSD 为1.87%，大黄素峰面积的RSD 为2.03%

2.4.9正交试验测定结果及方差分析 按照正交试验设计表进行回流提取，得到9 份提取液，根据综合评分法[9-10]，依据小檗碱、大黄酸、大黄素以及出膏率的重要性确定小檗碱的提取量权重0.4，大黄酸的提取量权重0.2，大黄素的提取量权重0.2，出膏率权重0.2，综合评分=小檗碱含量/小檗碱最大含量×40%+大黄酸含量/大黄素最大含量×20%+大黄素含量/大黄素最大含量×20%+出膏率/出膏率最大值×20%，结果见表2，方差分析见表3。

表2 L9（34）正交试验结果

表3 正交实验结果数据方差分析表

根据表2-3 方差分析表明，各因素对提取影响大小的顺序为提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量，其中提取次数对结果有显著性影响，考虑到各类成本、能源消耗，时间成本，选定工艺为：A3B1C3D3，即用6 倍90%乙醇回流3 次，每次2h，浓缩，即制得流浸膏。

2.5提取工艺验证试验 为确保本试验的准确性，按照处方比例称取中药饮片3 份，每份按以下条件提取：乙醇浓度为90%，乙醇用量为6 倍，提取时间为2h，提取次数为3 次，测得小檗碱2678.97μg/mL（RSD=1.05%），大黄酸487.57μg/mL（RSD=1.89%），大黄素89.57μg/mL（RSD=2.31%），平均出膏率为17.52%（RSD=1.56%）。表明该工艺稳定、可靠。

3 讨论

痔瘘凝胶作为中药制剂，其组成成分复杂，采用单一考察指标的提取工艺往往不够全面，故本研究选用多个指标进行筛选，同时出膏率也是一个重要的指标，能整体反映提取的效率，具有现实意义。

初期HPLC 分析选用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150mm，5μm），流动相选用为甲醇（A）-磷酸盐缓冲液（B）[11]，发现分离情况极不理想，无法实现分离目的。大黄酸更是因为在甲醇中溶解度较低，以及成分可能存在解离，标准品谱图中时常出现较多杂峰。经过反复的筛选，最后将选用色谱柱AgilentZORBAX XDB-C18 柱（4.6×150mm，5μm）流动相甲醇-磷酸盐缓冲液换成为乙腈-磷酸盐缓冲液（90∶10），小檗碱、大黄酸、大黄素的分离度达到检测的要求。最终确定痔瘘凝胶的最佳提取条件为用6 倍于药材量90%乙醇作提取溶剂，回流提取3 次，每次2h。本法简便、选择性好、提取效率高，经济，工艺稳定可靠，为痔瘘凝胶的大批量工业化生产奠定了基础。