血清miR-378 和miR-216b 对早期非小细胞肺癌的诊断价值

吴立新 黄慰虎 陈晓杰 李晓峰

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的常见类型，每年死亡人数不断增加，晚期生存率较低[1]。尽管在手术、放疗、化疗和特定靶向治疗方面取得了进展，但由于诊断发现晚，导致其预后仍不理想，进而出现癌细胞的转移[2]。大量的基因组学研究将肺癌与抑癌、致癌基因的表达、染色体畸变、氧化应激等因素相联系，这些因素影响了包括细胞生长、分裂、增殖、存活、运动、侵袭和细胞内追踪等多种细胞功能[3]。miR-378 和miR-216b 是近年来miRNA 家族中研究较多的两种。研究显示，miR-378 在多种肿瘤患者的血清中呈现高表达状态，而miR-216b 呈低表达状态。同时miR-378 和miR-216b 表达水平与患者肿瘤恶性程度具有一定的相关性[4-5]。但是目前关于这两种miRNA 的交互作用和其在肺癌中的研究报道较少，因此本研究采用RT-qPCR 技术检测NSCLC 患者血清miR-378 和miR-216b 表达水平，并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1研究对象 前瞻性选择2017 年4 月至2018 年10 月浙江省荣军医院收治的NSCLC 患者86 例（观察组）作为研究对象，年龄44～79（60.24±14.25）岁；另选取同期医院健康体检人员86 名（对照组）作为对照，年龄43～77（59.43±13.26）岁。本研究经医院伦理委员会批准（伦审：2017023）。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：（1）经病理确诊为早期NSCLC；（2）临床资料完整；（3）未进行任何放化疗；（4）未进行手术治疗；（5）所有对象知情同意。排除标准：（1）妊娠哺乳；（2）患者伴有严重心、脑、肝、肾等重要器官功能障碍；（3）合并患有其他严重呼吸系统疾病；（4）其他恶性肿瘤。

1.3主要试剂及仪器 RNA 提取试剂盒（批号20132154）、RNA 反转录试剂盒（批号2041245）、RTqPCR 试剂盒（批号2145874）均购自上海优宁维生物有限公司。伯乐Mini-PRO 荧光定量PCR 仪（美国伯乐公司）。

1.4总RNA 提取及RT-qPCR 检测 根据RNA 提取试剂盒提取86 例NSCLC 患者和86 名健康体检人员血清中总RNA，并利用反转录试剂盒得到cDNA，保存至-80℃备用。引物序列如下：miR-378正向：5'-TGGGCTAGCTAGCTGAGGGGATCGATCTCGATGCTAGCTGA-3'，反向：5'-TGGGCTGCTGCTAGCTAGTCGATCGATGCTAGCTAGCTGCTAG -3'；miR -216b 正向：5'-TGCGCTAGCTAGCTGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGTCGCC-3'，反向：5'-TGCGATCGATCGTAGCTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGTCGATG-3'（中国碧云天生物科技有限公司合成）。RTqPCR 体系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25μL，特异性引物2.0μL，模板cDNA 3.25μL，DEPC 水补足 至30μL。反应条件为：95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s；70℃，30s；共40 个循环。设置3 个复孔，根据公式（2-ΔΔCT法）计算miRNA 表达。

1.5随访 以门诊或电话随访的方式对所有患者进行2 年随访，随访周期为6 个月1 次，随访终点为2020 年12 月或患者死亡。

1.6统计学方法 应用SPSS 23.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）描述，采用两独立样本t 检验或配对t 检验比较；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验比较；采用ROC 曲线评价血清miR-378 和miR-216b 对早期NSCLC 诊断价值，预后相关因素采用多因素Cox 回归分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组研究对象一般资料比较 两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2两组研究对象血清miR-378 与miR-216b 表达水平比较 与对照组比较，观察组血清miR-378 水平更高，miR-216b 水平更低（P＜0.05），见表2。

表2 两组研究对象血清miR-378 与miR-216b 水平比较（）

表2 两组研究对象血清miR-378 与miR-216b 水平比较（）

注：对照组为健康体检人员；观察组为非小细胞肺癌患者；miR-378为微小RNA-378；miR-216b 为微小RNA-216b

2.3NSCLC 患者手术前后血清miR-378 与miR-216b 表达水平比较 与手术前比较，手术后患者血清miR-378 水平降低，miR-216b 水平升高（P＜0.05），见表3。

表3 NSCLC 患者手术前后血清miR-378 与miR-216b表达水平比较（）

表3 NSCLC 患者手术前后血清miR-378 与miR-216b表达水平比较（）

注：NSCLC 为非小细胞肺癌；miR-378 为微小RNA-378；miR-216b 为微小RNA-216b

2.4血清miR-378 与miR-216b 对早期NSCLC 的诊断价值 血清miR-378 诊断早期NSCLC 的曲线下面积为0.874，最佳截断值为5.28，敏感度为81.39%（70/86），特异度为84.88%（73/86）；血清miR-216b 诊断早期NSCLC 的曲线下面积为0.845，最佳截断值为4.96，敏感度为79.07%（68/86），特异度为87.20%（75/86），见图1。

图1 血清miR-378 与miR-216b 对早期NSCLC 的诊断ROC 曲线

2.5血清miR-378 与miR-216b 水平与NSCLC 患者临床病理特征的关系 以手术前患者血清中miR-378 和miR-216b 表达水平均数8.13 和3.61 为界值，将患者分为miR-378 低表达组（41 例）和miR-378 高表达组（45 例），miR-216b 低表达组（44例）和miR-216b 高表达组（42 例）。两组患者年龄和性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组患者肿瘤分期、有无淋巴转移和肿瘤直径比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 血清miR-378 与miR-216b 水平与NSCLC 患者临床病理特征的关系[例（%）]

2.6miR-378、miR-216b 表达水平与NSCLC 患者预后的关系 随访术后2 年生存率79.07%（68/86）。miR-378 低表达组术后2 年生存率90.24%（37/41），miR-378 高表达组术后2 年生存率68.89%（31/45），miR-378 低表达组生存率高于miR-378 高表达组（χ2=5.883，P=0.015）。miR-216b 低表达组术后2 年生存率72.72%（32/44），miR-216b 高表达组术后2 年生存率85.71%（36/42），miR-216b 高表达组生存率高于miR-216b 低表达组（χ2=4.782，P=0.029）。

2.7NSCLC 患者预后影响因素多因素Cox 回归分析 多因素Cox 回归分析得出，肿瘤分期Ⅱ期、淋巴转移、肿瘤直径≥3cm、miR-378 水平＞8.13 和miR-216b 水平＜3.61 均是影响早期NSCLC 患者预后危险因素（P＜0.05），见表5。

表5 早期NSCLC 患者预后影响因素多因素Cox 回归分析

3 讨论

NSCLC 约占肺癌的80%，相较于小细胞肺癌，NSCLC 细胞生长较为缓慢，患者出现扩散的时间相对较晚[6-7]。不同类型肺癌治疗方法不同，导致肺癌的治疗过程更加复杂，通过基因调控针对性治疗肺癌已成为目前研究的热点[8]。因此寻找有效且新颖的检测指标和治疗靶点，对提高NSCLC 患者预后具有重要意义。

miR-378 和miR-216b 已被证实在多种肿瘤中发挥着重要作用[9]。在肝癌、子宫内膜癌和胃癌患者血清中miR-378 和miR-216b 均表达异常，二者可作为肿瘤诊断的有效指标[10-11]。Keller 等[12]研究发现，肾母细胞瘤细胞miR-378 表达升高，靶向抑制miR-216b 表达，进而增加细胞增殖和转移能力。本研究发现，NSCLC 患者血清miR-378 高于对照组，miR-216b 低于对照组；血清miR-378 和miR-216b 诊断早期NSCLC 的曲线下面积为0.874 和0.845，表明肺癌的发生会引起机体血清miR-378 高表达和miR-216b 低表达，因此miR-378 和miR-216b 异常表达可能与肺癌发生相关，有望作为诊断NSCLC 的生物标志物。同时本研究还发现手术后患者miR-378 降低，miR-216b 升高，表明当疾病终止时，患者血清miR-378 和miR-216b 趋向正常，进一步说明miR-378 和miR-216b 与肺癌发展密切相关，也提示miR-378 和miR-216b 有成为肺癌治疗靶点的可能性。

已有研究发现，miR-378 和miR-216b 对肿瘤细胞分化、增殖及转移均有调控作用[13]。miR-378 高表达可作用于抑癌基因的上游靶位点，从而抑制抑癌基因表达，为肿瘤细胞的增殖和分化提供良好的体内环境基础[14]。本研究发现，肿瘤分期越高、淋巴转移和肿瘤直径≥3cm 的NSCLC 患者血清miR-378水平增高，miR-216b 水平降低，这表明miR-378 和miR-216b 表达水平与患者疾病进程密切相关，进一步说明miR-378 和miR-216b 可作为NSCLC 诊断生物标志物。本研究还发现，miR-378 高水平组和miR-216b 低水平组患者术后2 年生存率显著降低，表明二者对患者术后康复情况具有一定的影响；结合多因 素Cox 回归分析，miR-378 ＞8.13 和miR-216b＜3.61 为早期NSCLC 患者预后危险因素，进一步表明miR-216b 高表达和miR-216b 低表达可能不利于NSCLC 患者预后。然而本研究存在一定局限性，后续研究中将通过基因敲除技术进一步探讨miR-378 和miR-216b 的相互联系，同时加大样本量的收集以确保研究结果的可靠性。

综上所述，在早期NSCLC 患者血清中，miR-378表达升高，miR-216b 表达降低。miR-378 高表达和miR-216b 低表达可能会导致NSCLC 患者预后不良风险增加，降低患者术后生存率，二者具有成为临床肺癌治疗靶点的潜质。