基于网络药理学探讨复方刺梨合剂抗胃癌作用机制及实验研究

蒋正立 朱 萍 任 宇 戴淑萍 陈 静

胃癌是一种常见消化系统肿瘤，其发病率仅次于肺癌、乳腺癌、肠癌和前列腺癌，而死亡率在所有癌症死因中排第3 位，严重危害人类健康[1]。大量研究发现，传统中医药在胃癌治疗方面效果明显，从中草药中寻找抗癌药物的各类研究一直受到人们的广泛重视。复方刺梨合剂是浙江省台州医院院内制剂，由刺梨与苍术组成，具有健脾燥湿、消食和胃之功效，对食积不化、胃脘胀满、泄泻等具有明确疗效。复方刺梨合剂抗胃癌作用尚未见报道，而前期文献研究发现，刺梨与苍术均对胃部肿瘤细胞有抑制作用[2-6]。网络药理学研究具有整体性和系统性，与中医药的辨证论治原则、整体观念相合，可用于发现复杂中药中的活性成分，进而识别靶标和预测适应证[7-9]。本研究采用网络药理学方法，预测和分析复方刺梨合剂抗胃癌药理作用机制，并进行实验初步验证，为深入研究其胃癌治疗作用提供参考。

1 材料与方法

1.1仪器 化学发光/荧光成像分析仪（Image-Quant，LAS500 北京盛科信德），电泳仪（1658033，美国赛默飞），半干转印槽（1703940，北京龙跃），高速冷冻离心机（AllegraX-15，美国贝尔曼）。

1.2药物及试剂 复方刺梨合剂（浙江省台州医院制剂室，201026），组织细胞总蛋白抽提试剂盒（杭州达文生物，P1250-50），预染蛋白（杭州达文生物，P1101），丽春红（杭州达文生物，P1503），1M Tris-HCl，pH6.8（杭州达文生物，B1002），pH8.0（杭州达文生物，B1011），ECL Plus 超敏发光液（杭州达文生物，P1052），封闭专用脱脂牛奶（杭州达文生物，P1622），Tween-20（上海生工生物工程，C500623），SDS（上海生工生物工程，A100227），Glycine（上海生工生物工程，A110167），SAGE 配胶试剂盒（杭州达文生物，AP014），5X loading buffer（杭州达文生物，B1034-5），Bcl-2 抗体（杭州达文生物，C1342），p53抗体（杭州达文生物，C1831），HRP-抗兔二抗（杭州达文生物，C2252），磷酸盐缓冲液（PBS），胃癌细胞株SGC-7901（中国科学院）。

1.3方 法1.3.1 活性成分筛选 以“刺梨”与“苍术”为主题词，从中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http∶//tcmspw.com/index.php）中寻找与这2 味中药相关的所有化学成分及对应靶点，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为化合物分子筛选条件，通过条件筛选，即为候选活性成分。

1.3.2活性成分-靶点筛选 基于TCMSP 查找活性成分靶点，同时登陆SwissTarget Prediction http∶//www.swisstargetprediction.ch/）服务器，上传复方刺梨合剂活性成分Sdf-mol 格式文件，采用反向药效团匹配方法，设置可能性Probability＞0，得到虚拟活性成分对应靶点。

1.3.3抗胃癌作用靶点筛选及PPI 网络构建 以“gastric cancer”等关键词搜索比较毒物遗传学数据库（CTD）（http∶//ctdbase.org/）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）（http∶//www.omim.org/）中已报道的胃癌相关靶点，选择既是活性成分靶标又是胃癌靶标的蛋白进行分析，筛选靶标。通过Cytoscape 3.7.1 软件构建药物-成分-靶点网络图。将复方刺梨合剂抗胃癌治疗的潜在关键靶点基因导入String 数据库平台（https∶//string-db.org/），选择物种为人类，获取蛋白质相互作用关系，绘制蛋白关系网络。

1.3.4GO 功能和KEGG 通路分析 采用WebGestalt（http∶//www.webgestalt.org/option.php）和DAVID 数据库（https∶//david.ncifcrf.gov/）对预测治疗靶点进行GO功能分析和KEGG 通路分析。

1.3.5实验研究 基于网络药理学，采用Western blot 法测定p53、Bcl-2 蛋白表达。取人胃癌细胞株SGC-7901，接种于10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，在37℃、5% CO2条件下培养。根据前期预实验结果将细胞分为对照组及实验组（浓度分别为80、120、160、240、320μg/mL）。收集对数生长期细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于6 孔板中，每孔2mL。按分组浓度添加含药培养基，每组设3 个复孔，于37℃、5% CO2条件下分别培养48 和72h。用0.25%胰酶消化收集细胞，并用预冷PBS 洗涤2 次。用1mL RIPA 裂解液于冰上提取蛋白，以12000r/min 离心15min，取上清液。蛋白质浓度测定后，以40μg/孔的上样量进行蛋白质电泳，半干转膜法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭2h。TBST 溶液洗涤PVDF 膜3 遍后，于4℃条件下孵育p53 及Bcl-2 抗体摇动过夜，洗脱一抗后孵育二抗，于避光条件下采用增强化学发光法（ECL）分析系统显影，并用ImageJ 软件计算分析条带灰度值。

1.3.6统计学方法 应用SPSS 25.0 统计软件对数据进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用One-way ANOVA 进行统计分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1活性成分 以“苍术”为关键词，从TCMSP 数据库中得到苍术活性成分49 个化学成分，根据OB≥30%，DL≥0.18 进行筛选，得到4 个活性成分，分别是NSC63551、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷、汉黄芩素、3β-乙酰氧基苍术酮。而TCMSP 数据库中并未收录刺梨，通过文献检索相关成分，包括黄酮、超氧化物歧化酶（SOD）、维生素C、三萜以及多糖等活性成分，进一步将其成分通过TCMSP 数据库，根据OB≥30%，DL≥0.18 进行筛选得到3 个活性成分（槲皮素、山奈酚、木犀草素）。此外，维生素C、芦丁和刺梨苷虽然不满足OB≥30%或DL≥0.18，但含量较高，同时文献研究表明，芦丁具有抗胃癌SGC-7901 细胞作用[10-11]，维生素C 也具有抗胃癌作用[12]，因此纳入活性成分，最后通过筛选共得到活性化合物10个，其中苍术4 个，刺梨6 个，具体见表1。

表1 复方刺梨合剂筛选后得到10 个活性成分

2.2活性成分-靶点 筛选相关作用靶点，通过Uniprot 数据库（https∶//www.uniprot.org/）的Uniprot ID对应至基因，共得到人源靶点基因236 个。

2.3复方刺梨合剂治疗胃癌作用靶点筛选及PPI 网络构建 以“gastric cancer”等关键词搜索CTD 和OMIM 数据库中已报道的与胃癌相关的靶点，共得到440 个胃癌相关靶点，选择既是成分靶标又是胃癌靶标的蛋白进行分析，共筛选到38 个靶标。通过Cytoscape3.7.1 软件构建药物-成分-靶点网络图（见图1），该网络包含2 种药物、1 种疾病、8 个活性成分、38 个靶点，连接度为前3 的潜在活性分子为quercetin、luteolin、kaempferol，关键靶点包括p53、Bcl-2、PIK3CA、Caspase8、CDK4 等。以上成分及靶点是复方刺梨合剂抗胃癌治疗的重要成分及重要靶点，对复方刺梨合剂治疗胃癌有重要意义。将38 个潜在的关键靶点基因导入String 数据库平台，绘制蛋白关系网络（见图2），该网络图共包括38 个节点，397 条边。其中综合数值评分＞0.995 的相互作用蛋白有CDK4-CCND1、CDKN1A-CDK4、BCL2L1-TP53、CDKN2A-CDK4、CDKN1A-CCND1、CDKN1A-TP53、MAPK8 -JUN、CASP8 -BCL2L1、PLAU -SERPINE1、CHEK2-TP53 等，这些蛋白之间的相互作用在网络中具有重要地位，靶点基因在复方刺梨合剂抗胃癌治疗中具有重要意义，可作为复方刺梨合剂有效成分作用的靶点基因。

图1 复方刺梨合剂药物、活性成分与胃癌关键靶点网络

图2 蛋白质关系网络图

2.4GO 功能和KEGG 通路分析 采用WebGestalt和DAVID 数据库进行GO 功能和KEGG 通路分析。如图3 所示，GO 功能分析显示显著功能有：对刺激反应（38/38）、生物调节（38/38）、细胞传递（36/38）、核（28/38）、胞质溶胶（25/38）、膜封闭腔（25/38）等。KEGG 通路富集结果显示，38 个靶点参与63 条显著KEGG 通路（根据Benjamini 校正法、PValue＜0.01），包括关键基因靶点主要富集的通路为HIF-1 信号通路、p53 信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等。且与胰腺癌、膀胱癌、大肠癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌等肿瘤密切相关，表明复方刺梨合剂的活性成分靶点分布于不同的通路，可通过各通路协调发挥抗癌作用。同时复方刺梨合剂的关键靶点基因富集于多种癌症通路上，提示此类型的癌症可作为未来研究复方刺梨合剂对抗癌疗效的重要方向。

图3 GO 功能分析结果

2.5实验研究 与对照组（0.28±0.02）比较，80μg/mL复方刺梨合剂处理48h 后，人胃癌细胞SGC-7901中p53 蛋白相对β-actin 表达量为（0.38±0.03，P=0.060），160μg/mL 和320μg/mL 复方刺梨合剂处理48h 后，p53 蛋白相对β-actin 表达量分别为（0.60±0.05，P=0.011）和（0.47±0.01，P=0.005）。与对照组（0.09±0.01）比较，80μg/mL 复方刺梨合剂处理48h后Bcl-2 相对β-actin 表达为（0.13±0.00，P=0.005），160μg/mL 和320μg/mL 复方刺梨合剂处理组的Bcl-2 相对β-actin 表达量分别为（0.10±0.01，P=0.771）和（0.11±0.01，P=0.127）。Western blot 实验结果显示（见图4），复方刺梨合剂使用后，p53 和Bcl-2 蛋白表达增加，且p53 相对β-actin 表达随着复方刺梨合剂浓度的增加而增加。

图4 p53 和Bcl-2 蛋白表达

3 讨论

复方刺梨合剂作为医院制剂，由刺梨与苍术组成，该配伍利用刺梨味甘性凉，结合苍术味辛性温之性味，发挥其燥湿健脾、祛风散寒之功效。目前对其研究也局限于制剂质量控制方面[13-14]，而关于其药理作用研究报道较少。

本研究基于网络药理学方法，通过TCMSP 数据库及文献筛选了10 个复方刺梨合剂的活性化学成分，得到236 个化合物靶点，苍术活性化学成分中汉黄芩素活性最高，作用于45 个靶点，刺梨活性化学成分中以槲皮素最高，作用于154 个靶点。通过CTD和OMIM 数据库中已报道的与胃癌相关的靶点，共得到440 个胃癌相关靶点，对蛋白进行分析，共得到38 个靶标，关键靶点包括p53、Bcl-2、PIK3CA、Caspase8、CDK4 等。在本研究中，采用WebGestalt 和DAVID 数据库进行GO 功能和KEGG 通路分析，筛选出HIF-1、p53、TNF、PI3K-Akt 等信号通路，表明复方刺梨合剂可通过调控各通路发挥抗癌作用。基于网络药理学研究结果，p53 和Bcl-2 为复方刺梨合剂抗胃癌的关键靶点。p53 基因是目前研究最深入、最广泛的肿瘤抑制基因之一，由11 个外显子和10个内含子组成，是一种负调节因子，其失活对肿瘤形成起重要作用，在临床中具有重要意义[15]。Bcl-2 基因为凋亡抑制基因，可通过阻碍细胞凋亡、促进细胞增殖、延长细胞寿命来增加肿瘤的发生，并促进肿瘤的发展[16]。不少学者研究表明，p53 在胃癌组织中高表达，与胃癌肿瘤直径、淋巴结转移、浸润深度、胃癌TNM 分期等密切相关，其异常表达表明p53 与胃癌的发生、发展、转移等有关[17-18]。多项研究显示，胃癌中Bcl-2 蛋白高表达参与胃癌的发生、发展[19-20]。因此，本研究采用Western blot 方法对网络药理学研究结果进行实验验证，结果表明，复方刺梨合剂可上调人胃癌细胞SGC-7901 中p53 和Bcl-2 蛋白表达。

综上所述，本文基于网络药理学方法及实验研究，揭示了复方刺梨合剂抗胃癌作用是多成分、多靶点、多通路的结果，可能通过调控p53 和Bcl-2 蛋白的表达发挥作用，为下一步深入研究其作用机制提供了思路。