解毒软肝合剂质量控制方法研究

刘丽琴 周晓霞 汪 涛 陈红斌 王 莹

解毒软肝合剂来源于浙江省中西医结合医院解毒软肝协定方，有十余年临床使用经验，治疗急慢性肝炎效果显著。解毒软肝合剂由白花蛇舌草、党参、垂盆草、米仁、板蓝根、焦山楂、叶下珠、乌贼骨、木瓜、五味子、土茯苓、炙甘草、赤芍等药材组成。其中白花蛇舌草、叶下珠、土茯苓、板蓝根清热解毒；垂盆草清热利湿；五味子益气养阴；赤芍清热凉血、活血祛瘀；党参、米仁、焦山楂、木瓜和乌贼骨健脾和胃；炙甘草调和诸药，全方共奏清热利湿、健脾和胃之效。该复方未建立完善的质量检测体系以评价内在质量。依据《浙江省医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案管理实施细则》[1]（以下简称《细则》）的要求，本研究使用薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）对炙甘草、叶下珠、赤芍进行定性鉴别，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）对赤芍中芍药苷进行定量检测，确保临床用药安全有效。

1 仪器与试剂

1.1仪器 Thermo Fisher U3000 高效液相色谱仪（DAD 二极管阵列检测器）；KQ-500DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AL204 电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂）。

1.2试药 芍药苷对照品（批号110736-201741）、没食子酸对照品（批号110831-201605）、甘草苷对照品（批号111610-201607）、甘草对照药材（批号120904-201620）购于中国食品药品检定研究院，芍药苷对照品（含量测定用，批号23180-57-6，98%），购于成都普瑞法科技有限公司。白花蛇舌草、党参、垂盆草、米仁、板蓝根、焦山楂、叶下珠、乌贼骨、木瓜、五味子、土茯苓、炙甘草、赤芍等中药饮片购于浙江惠松制药有限公司。解毒软肝合剂（浙江省中西医结合医院院内制剂，批号分别为181029、181030、181031）；乙酸乙酯、甲苯、三氯甲烷、甲醇、无水乙醇、甲酸、三氯化铁、乙酸、正丁醇、香草醛、硫酸、磷酸均为分析纯；甲醇为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1TLC 鉴别

2.1.1炙甘草 取解毒软肝合剂20mL 蒸干，剩余残渣部分加入甲醇30mL，加热回流提取1h，之后过滤并蒸干滤液，取纯化水40mL 溶解残渣，加入正丁醇20mL 进行萃取并重复3 次，合并3 次正丁醇溶液，加入少量纯化水洗涤3 次，分离正丁醇部分，之后蒸干，剩余残渣用甲醇5mL 溶解，为供试品溶液备用[2-3]。取适量甘草苷对照品，以甲醇为溶剂，配得2mg/mL 溶液作为对照。取甘草饮片1g，同法得药材对照溶液。取解毒软肝合剂中其余饮片（除炙甘草外），根据原始处方工艺，水煎得阴性成品，并按上述方法得对照溶液，作为阴性样品。依据薄层色谱法《中国药典》2015 版四部（通则0502）[2]，使用毛细管取上述四种样品溶液1～2μL，点于一块硅胶板上，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）溶液，显色剂为10%硫酸乙醇溶液，105℃加热显色，于日光及紫外光灯（365nm）下检视。TLC 结果显示，对照药材和对照品色谱出现相似斑点，而阴性样品则未出现干扰，见图1。

图1 炙甘草薄层色谱图

2.1.2叶下珠 取解毒软肝合剂20mL 蒸干，在残渣部分加入乙醇10mL，振荡5min 后过滤，蒸干乙醇，使用1mL 乙醇溶解残渣，作为供试品备用。取适量没食子酸对照品，以甲醇为溶剂，得1mg/mL 溶液为对照[4]。取解毒软肝合剂中其余饮片（不含叶下珠），根据原始处方及工艺，水煎得阴性成品，并按上述方法得对照溶液，作为阴性样品。根据薄层色谱法《中国药典》2015 年版四部（通则0502），使用毛细管吸取对照品、供试品溶液各5μL 点于同一硅胶板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6∶10∶1），显色剂为1%三氯化铁乙醇溶液，于日光下检视[4]。TLC 结果显示，在同一位置上，供试品与对照品显示近似斑点，且阴性样品未产生干扰，见图2。

图2 叶下珠薄层色谱图

2.1.3赤芍 取解毒软肝合剂20mL 蒸干，于残渣处加入乙醇10mL，振荡5min，过滤蒸干，加入乙醇1mL 溶解残渣，作供试品备用。取适量芍药苷对照品，以乙醇为溶剂，得1mg/mL 溶液为对照。取解毒软肝合剂中其余饮片（不含赤芍），根据原始处方工艺，水煎得阴性成品，并按上述方法得对照溶液，作为阴性样品。根据薄层色谱法《中国药典》2015 年版四部（通则0502）试验，吸取对照品、供试品各2μL 于同一硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）为展开剂，以5%香草醛硫酸溶液为显色剂，加热至斑点显色清晰，日光下观察[5-6]。TLC 结果显示，供试品与对照品于对应位置呈现相同颜色斑点，阴性样品则无干扰，见图3。

图3 赤芍薄层色谱图

2.2HPLC 含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；流动相流速：1.0mL/min；梯度洗脱程序：0～30min 14% A；30～60min 14%～90%A；60～61min 90%～14% A；61～70min 14% A；进样量：10μL；检测波长：230nm；柱温：30℃。

2.2.2芍药苷对照品溶液配制 精密称取适量芍药苷对照品，以甲醇为溶剂，配成0.05707mg/mL 芍药苷对照品溶液。

2.2.3供试品制备 精密量取解毒软肝合剂1mL 于50mL 容量瓶，加入适量乙醇，超声处理（250W，40kHz）30min，放冷后定容至刻度，经0.45μm 微孔滤膜得供试品溶液。

2.2.4专属性试验 参考解毒软肝合剂处方及工艺，制得阴性样品（不含麸炒枳壳），按“2.2.3”法配制阴性溶液备用。精密吸取芍药苷对照品、供试品及阴性对照各10μL，使用HPLC 分析。结果显示，阴性样品无干扰，见图4。

图4 高效液相色谱图

2.2.5线性关系考察 精密吸取适量“2.2.2”中芍药苷对照品溶液，逐级稀释，配成5 份对照溶液，浓度依次为：0.1177、0.2354、0.3531、0.4708、0.5885mg/mL，精密吸取上述浓度系列对照溶液10μL，使用“2.2.1”条件进行HPLC 分析。对峰面积（Y）和浓度（X，mg/mL）关系进行拟合，得线性方程：Y=1209.474X+10.589，R2=1.000，在0.1177～0.5885μg 范围内呈现良好线性关系。

2.2.6仪器精密度试验 精密吸取“2.2.2”中芍药苷对照溶液，重复进样5 次，得芍药苷峰面积RSD 为0.66%，表明本研究所用高效液相色谱仪精密度良好。

2.2.7重复性考察 取解毒软肝合剂（批号181029），按“2.2.3”法平行制备6 份待测溶液，使用HPLC 分析，得芍药苷峰面积RSD 为1.63%，表明本研究建立的含量测定方法重复性良好。

2.2.8稳定性考察 取解毒软肝合剂（批号181029），按“2.2.3”法配制供试溶液，分别于0、2、4、8、12、24h取样检测，得芍药苷峰面积RSD 为0.53%，表明解毒软肝合剂在24h 内保持稳定。

2.2.9加样回收率考察 精密量取0.5mL 解毒软肝合剂（已知含量）6 份，加入定量芍药苷标准品，根据“2.2.3”法配制待测溶液，使用HPLC 分析。计算得样品回收率平均值为99.06%，RSD=1.36%，计算公式如下，结果见表1。

表1 芍药苷加样回收率（n=6）

2.2.10样品含量测定 取3 批解毒软肝合剂各3份，以“2.2.3”法制备待测溶液，采用HPLC 分析，以外标法计算样品含量，结果见表2。

表2 样品测定结果（n=3）

3 讨论

3.1TLC 鉴别药味的选择 本研究采用TLC 对解毒软肝合剂中的炙甘草、叶下珠、赤芍、板蓝根及党参5 个药味进行研究，发现党参样品存在显著的阴性干扰，板蓝根样品的斑点不清晰，而炙甘草、叶下珠、赤芍的鉴别效果好，专属性强，分离度高，且阴性样品不存在干扰，因此选择TLC 定性鉴别炙甘草、叶下珠、赤芍，作为解毒软肝合剂的质量控制指标。

3.2TLC 鉴别湿度条件考察 湿度易影响TLC 结果，本研究比较不同湿度条件下炙甘草、叶下珠、赤芍的薄层展开效果。结果发现，在不同湿度条件下，样品斑点均能达到较好分离，方法的耐用性较好。

3.3HPLC 定量指标的选择[7]前期研究发现，君药白花蛇舌草和叶下珠在《浙江省中药炮制规范》2015版中均没有含量测定项。而预实验发现，赤芍中的芍药苷含量较高，故本品以芍药苷为指标成分，使用HPLC 法测定含量。结果表明，本研究建立的液相方法定量准确，误差小，可用于解毒软肝合剂中芍药苷含量的测定。

3.4洗脱系统的选择[8-12]解毒软肝合剂组分多，化学成分复杂，因此需要复杂的流动相体系以分离待测组分。本实验考察不同流动相系统（乙腈-水、乙腈-0.5%冰醋酸溶液以及乙腈-0.1%磷酸溶液），结果以乙腈-0.1%磷酸水溶液系统梯度洗脱分离效果最佳。液相图谱上各个色谱峰分离度较好，基线较平稳，保留时间适中。经方法学考察，线性、重复性、回收率等均符合要求。

综上所述，本研究针对解毒软肝合剂建立TLC鉴别及HPLC 含量测定相结合的质量控制体系，该体系操作简便，快捷准确，具有良好的重复性、稳定性，能够较为全面地测定解毒软肝合剂的有效成分，控制合剂整体质量，进而保证临床应用的安全有效。