水产养殖饲用微生态制剂研究进展

王国旭， 吴又多，， 胡馨月， 雷 茜， 车 鉴, 3， 徐永平, ， 李淑英， 薛 闯*

(1.大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116024；2.大连赛姆生物工程技术有限公司，辽宁 大连 116000；3.大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司，辽宁 大连 116222)

我国最早于1990年微生态学会学术研讨的会议纪要中第一次提出关于“微生态制剂”这一概念[1]，是指利用动物或环境中筛选、分离、鉴定出的益生功能菌株，经过人工选育、发酵、制剂等工艺制备而成的具有调节动物营养保健及微生态平衡等功效的活菌制剂[2]。微生态制剂作为饲料添加剂，在畜禽及水产养殖行业得到广泛应用，能够调节动物肠道微环境，增强机体免疫力，促进生长发育，提高养殖产能与经济效益[3]。更为重要的是，水产养殖饲用微生态制剂还起到净化环境水质，降低营养氮素累积的作用，其带来的环境友好及可持续发展效益十分显著。根据中国知识产权局专利信息中心统计，我国微生态制剂发明专利最早申请于1990年，截至2020年，微生态制剂发明专利申请数共计2 199项，其中畜禽养殖饲用制剂占比居首位，水产养殖饲用制剂紧随其后。随着我国农业农村部第194号和246号公告的颁布实施，自2018年启动实施兽用抗菌药使用减量化行动，自2020年1月1日起停止生产进口促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)，需每年组织开展兽药残留监控和动物源细菌耐药性监测。基于此，微生态制剂势必发挥重要的“减抗、替抗”作用，未来发展空间及市场容量极其可观。

1 水产养殖饲用微生态制剂概述

根据《生物饲料标准及常用饲料法律法规(2019)》及《饲料添加剂品种目录农业部公告第2045号(3次修订)》，水产养殖饲用益生菌主要包括芽胞杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillusbeijerinck)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)、片球菌(Pediococcus)、酵母菌(Yeast)、曲霉菌(Aspergillus)及光合细菌(Photosynthetic bacteria)等32种功能微生物，如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)及沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)等。如表1所示水产养殖饲用益生菌种类及功能，首先，这些益生菌大多为兼性厌氧微生物，其肠道定殖与生存能力较强，能够快速改善肠道菌群结构，通过肠道氧气竞争，分泌细菌素、胞外多糖、几丁质酶及蛋白酶等效应，有效抑制病原微生物的滋生，从而起到防病治病的作用[4]。其次，这些益生菌能够在机体内产生多种生物活性物质，如游离氨基酸、维生素、益生因子等能够增强益生菌群的协同共生作用，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等能够促进饲料消化与营养吸收，加快机体生长发育与增产增重。另外，这些益生菌还具有氧化、氨化、硝化、固氮等功能，可以将养殖水体中的饲料残渣、动物排泄物等大分子有机物降解为二氧化碳、碳酸盐、磷酸盐和硫酸盐等小分子化合物，有效减少氨氮、亚硝酸盐等毒害物质的积累，进而促进藻类光合作用及水质净化[5]。

表1 水产养殖饲用益生菌种类、代谢产物及调节作用Table 1 Species, metabolites and functions of probiotics used in aquaculture microecologics

续表1

2 养殖饲用微生态制剂的研究进展

据国家统计局发布的数据显示，2019年我国鱼类水产总产量高达3 746.9万t，占水产总量的57.82%，虾蟹养殖产量达到782.71万t，占水产总量的12.08%。鱼肉富含蛋白、钙、磷及维生素等营养物质，而虾肉中脂肪含量更少，蛋白含量可达20%，远高于鱼肉蛋白含量，且富含钾、碘、镁、磷、维生素A等中、微量营养元素。除鱼虾水产品外，2019年我国海参养殖面积达到24.67万hm2，年产量17.17万t，养殖规模居世界第一，直接经济收益超过300亿元。海参具有高蛋白、低糖、低脂等特点，其蛋白含量高达80%，富含必需氨基酸及脂肪酸、维生素、酸性粘多糖、皂苷和胶原蛋白等有效活性成分，具有显著的抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血压、降血脂、增强免疫等功效。早在1994年，微生态制剂就已成功用于虹鳟鱼养殖过程。后续研究工作及养殖应用结果表明，微生态制剂在鱼类、虾类、海参养殖过程中均发挥着重要的调节作用，至今已广泛应用于草鱼、杂交鲟、鲈鱼、罗非鱼、锦鲤、大口黑鲈、黄颡鱼、凡纳滨对虾、南美白对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾以及海参等水产养殖行业。总体来说，微生态制剂及其益生菌在鱼类、虾类、海参养殖中发挥的共性调节作用表现为补充益生菌群，抑制病原微生物滋生，提高养殖个体成活率，增强饲料利用与营养吸收，提高机体生长率与增重率，缩短养殖周期，改善环境水体质量(表2)。

表2 微生态制剂及其益生菌在鱼虾及海参养殖中的调节作用Table 2 The functions of microecologics and probiotics in fish, shrimp and sea cucumber aquaculture

2.1 微生态制剂在鱼类养殖中的应用

近年来，针对鱼类养殖产能与鱼肉营养品质，国内外研究者在鱼类饲用益生菌及微生态制剂开发方面取得了重要工作进展。例如，沈文英等[21]在饲料中添加枯草芽胞杆菌制剂，草鱼增重率和生长率分别提高21.78%和6.67%，血清免疫球蛋白、补体含量分别提高了100%、123.08%，碱性磷酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶水平分别提高108.87%、44.23%和11.01%，机体总抗氧化能力提高了18.31%，肝胰还原型谷胱甘肽和抗氧化能力分别提高了51.39%和37.6%，表明机体自由基得到有效清除，鱼肉脂质过氧化得到缓解。邱燕[22]在饲料中按2 000 mg/kg比例添加枯草芽胞杆菌制剂，饲喂后的草鱼比生长速率增加30.85%，肠道淀粉酶和蛋白酶活性分别提高32.15%和27.29%，料肉比下降31.22%，蛋白质和脂肪沉积率分别提高5%和23%，鱼肉组成及品质得到显著改善。张书环等[23]将枯草芽胞杆菌制剂按0.1%比例混拌饲料后饲喂杂交鲟，实验结果显示个体增重率与比生长速率分别提高了22.5%和0.02%·d-1。

除普遍使用的枯草芽胞杆菌制剂外，Midhun等[24]在饲料中按108cfu/g添加量混拌多粘芽胞杆菌制剂，罗非鱼比生长速率由0.82%·d-1增至1.58%·d-1，饲料转化率由0.22%降至0.10%，单体增重提高了89.03%。Serra等[25]在饲料中混拌蜡样芽胞杆菌等复合制剂，欧洲鲈鱼肠道菌群结构得到明显改善，同时对葡聚糖、木聚糖、半乳聚糖等糖类消化能力增强。乳酸菌、光合细菌及硝化细菌在鱼类养殖中也发挥着重要调节作用，如Mohammadian等[26]研究发现，在鱼饲料中添加5×107cfu/g嗜酸乳杆菌或保加利亚乳杆菌，虹鳟鱼肠道消化酶活性和菌群结构得到改善，同时机体免疫调节蛋白水平及非特性免疫应答能力也得到相应提升。史东杰等[27]利用丁酸梭菌、粪肠球菌及枯草芽胞杆菌混合制剂饲喂锦鲤，雌鱼性腺发育加快，多不饱和脂肪酸含量提高40.9%，绝对繁殖力和体质量相对繁殖力分别提高11.96%和9.57%，幼鱼孵化率由80.77%增至85.13%。王赛赛等[28]利用酵母菌、乳酸菌、光合细菌、放线菌、硝化细菌、芽胞杆菌混合制剂，按0.5%比例混拌饲料后喂食大口黑鲈，雌鱼性腺指数达到5.23%，怀卵量、相对怀卵量分别提高44.5%和42.66%，此外机体超氧化物歧化酶活性在产卵前达到峰值370 U/mg，提高了15.63%，显著调节了机体免疫力与抗氧化能力。

2.2 微生态制剂在虾类养殖中的应用

目前，虾类养殖往往受病毒、细菌、真菌、寄生虫等因素引发的病害影响，传统防病治病方案普遍使用大量抗生素、免疫增强剂、环境改良剂等化学药物，但不可避免地会造成细菌耐药性，甚至水体环境的二次污染。多项研究表明，使用微生态制剂可显著调节凡纳滨对虾、南美白对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾等养殖过程，一方面缩短虾体生长周期，提高生长率，增加个体重量，增强机体免疫力，另一方面净化水体环境，降低氮素过剩累积。例如，刘文亮[29]在饲料中按1%比例混拌蜡样芽胞杆菌制剂，凡纳滨对虾生长速率提高15.2%，肠道变形菌门比例由68.30%降至57.94%，弧菌比例由5.40%降至1.94%，病原微生物侵染及病害发生风险降低。Khademzade等[30]利用蜡样芽胞杆菌混拌饲料，南美白对虾存活率提高13.38%，水体中硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮含量分别降低48.15%、6.67%和20.48%，对虾产量和净收入分别提高27.30%和92.94%。朱光来等[31]在罗氏沼虾饲料中按3%比例添加枯草芽胞杆菌制剂，沼虾存活率由56%提高至78%，采食量提高129.51%，料重比由3.69降至1.71，比生长速率提高45.53%，个体重量提高3.4倍，虾肉蛋白组成含量提高。骆玉玲等[32]使用复合芽胞杆菌制剂饲喂克氏原螯虾，养殖水体中氨氮、亚硝酸盐、透明度分别降低69.6%、54.5%、23.5%，虾体成活率提高12.8%，养成规模提高27.8%。

除了使用上述单一芽胞杆菌制剂外，其他功能益生菌如肠球菌、单胞菌、乳杆菌、酵母等对虾类水产养殖同样具有重要调节作用。朱成坤等[33]自虾体肠道筛分出坚忍肠球菌和枯草芽胞杆菌，利用二者混合制剂饲喂罗氏沼虾，监测发现实验组酚氧化酶活性提高了48.24%，溶菌酶活性提高了198%，肠道蛋白酶活性提高了84.8%，弧菌数量下降了59.76%。练小军等[34]以白斑综合征病毒、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌侵染的凡纳滨对虾为研究对象，发现假交替单胞菌、微小杆菌均具有显著的病原菌拮抗作用。当饲料中仅添加假交替单胞菌制剂时，对虾存活率提高213%，平均生长率提高45.3%；当饲料中仅添加微小杆菌制剂时，对虾存活率提高48.63%，平均生长率提高105.2%；当同时添加两种制剂时，对虾存活率提高184%，平均生长率提高70.6%。樊英等[35]使用商业饲用微生态制剂，主要包含干酪乳杆菌、酿酒酵母等，饲喂凡纳滨对虾后，实验组机体酸性磷酸酶、过氧化物酶活性分别提高近4倍和1.5倍，同时非特异性免疫增强；此外，谷丙转氨酶与谷草转氨酶活性降低，而淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶等消化酶活性提高，有效促进了饲料消化与营养吸收。

2.3 微生态制剂在海参养殖中的应用

海参养殖易受到假单胞菌、灿烂弧菌、霉菌、纤毛寄生虫、盾纤毛虫等病原菌及寄生虫的侵害，发病多见腐皮综合征、烂胃病、霉菌病、后口虫病等病害，传统防病治病手段多使用四环素类、磺胺类、喹诺酮类、酰胺醇类、大环内酯类抗生素。2020年，我国全面禁止使用抗生素，同时需每年组织开展兽药残留监控和动物源细菌耐药性监测，亟待开发绿色替抗及高效水产养殖技术，实现海参快速生长发育与增产增重，同时提高成活率、减少发病率，已成为国内外研究学者和养殖业者的关注热点。相关研究表明，海参饲用益生菌主要使用芽胞杆菌、乳杆菌、酵母等微生物。Zhao等[36]在饲料中按109cfu/g添加枯草芽胞杆菌，幼参增重率提高30.14%，肠道淀粉酶和胰蛋白酶活性分别提高8%和93.62%，饲料中碳水化合物和蛋白质转化利用加快，弧菌等主要病原微生物数量大幅降低。Chao等[37]在海洋鱼类肠道中分离、鉴定出一株植物乳杆菌，制剂后添加至饲料中，实验组参体比生长速率提升0.28%·d-1；当利用病原菌侵染海参后，实验组海参存活率提高18.6%，且参体中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性分别提高1.6倍、2倍及0.5倍，有效刺激了海参生长发育与免疫应答。Ma等[38]在饲料中添加海洋红酵母和梅奇酵母复合制剂，饲料吸收利用加快，海参比生长速率提高0.5 %·d-1，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分别提高34.29%、47.95%和72.23%，肠道总益生菌数量增加了1倍，弧菌等病原菌数量降低了17.51%。包鹏云等[39]将梅奇酵母、红酵母、芽胞杆菌按1∶1∶10形成复合制剂，饲喂后的海参肠道弧菌数量下降86.3%，胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分别提高126.87%、41.55%、42.47%和85.76%，体壁蛋白和糖组成含量分别提高11.98%和14.62%。王光玉等[40]将投喂饲料与商业EM菌剂按2∶1的比例混合，饲喂后的海参生长率提高2.92%，蛋白酶、纤维素酶、褐藻酸酶、淀粉酶活性分别提高32.68%、33.12%、36.33%和35%，养殖水体中亚硝态氮、氨氮含量下降28.89%和40.25%，水质得到净化，有效抑制了病原微生物滋生。另一项相似研究中，王圣等[41]将商品斗山制剂饲喂刺参后，其生长率和成活率分别提高了0.42%和11.11%，碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性提高了3倍，淀粉酶和蛋白酶活性分别提高了2.2倍和4.2倍，养殖水体中氨氮和亚硝酸氮含量分别降低75.9%和67.0%。

总体来说，鱼虾及海参水产养殖饲用微生态制剂普遍使用芽胞杆菌、乳杆菌、酵母菌、硝化细菌等多种益生菌，这些微生物适宜生长温度范围多为25～37 ℃，然而养殖水体温度往往控制在25 ℃以下。如表3所示，以海参养殖为例，生长阶段主要划分为育苗期、雏参期、幼体及养成期，其中育苗期需要控制水体温度在20～22 ℃，雏参期以19～25 ℃为宜，幼体及养成期温度需降至10～18 ℃为最佳[42]。因而，使用益生菌的生长增殖、代谢合成及产物活性极易受低温环境影响，导致制剂大量使用或补充使用，且益生菌(群)无法发挥理想的生物效价，进而影响水产养殖产能与经济效益，因此亟待开发适宜低温水产养殖的优良益生菌菌种资源。与此同时，益生菌是发酵制剂工艺的核心，高密度细胞发酵能够显著提高有效活菌数，而利用多种微生物的混合菌株发酵，是实现益生菌群及活性代谢产物功能互补、协同互作的有效途径，因而开发高效菌种选育、发酵优化等关键生物技术，对于提升饲用微生态制剂功能性至关重要。

表3 海参养殖温度条件、常见病害及饲用益生菌特点Table 3 Culture temperature, diseases and probiotics for sea cucumber aquaculture

3 养殖饲用益生菌的研究进展

3.1 优良益生菌选育

为了提高水产养殖饲用益生菌的生物效价与应用效果，可从动物体内或特定环境中分离、纯化、筛选功能微生物，基于产酶活性、抑菌活性及胁迫耐性选育高性能益生菌，选育菌株多以芽胞杆菌为主。谷舞[43]从凡纳滨对虾肠道中获得33株芽胞杆菌，分别利用脱脂牛乳培养基、淀粉培养基和脂肪培养基进行产酶活性指标检测，其中1株芽胞杆菌具有淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶高产特性，将该菌发酵制剂混拌饲料后，凡纳滨对虾比生长速率、饲料利用率及增重率分别提高22.5%、30.3%和47.1%；在副溶血弧菌侵染实验中，芽胞杆菌饲喂组对虾死亡率由56%降低至21%。王晓云[44]从罗非鱼养殖水体中筛得7株枯草芽胞杆菌，通过透明圈法和福林酚法发现菌株BY7具有较高蛋白酶活性，最高酶活性可达43.28 U/mL，较商业菌株提高了2.6倍。刘晓燕等[45]通过形态鉴定和16S rRNA测序分析，从对虾养殖环境中筛得1株枯草芽胞杆菌，其具有良好耐高温、耐胃酸、耐胆盐特性，并能有效拮抗金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌，将该菌按5×105cfu/mL投入养殖水体，环境中亚硝态氮、氨氮含量分别降低了70.49%、 77.63%。

除上述芽胞杆菌以外，Ratchanu等[46]对鱼肠道及发酵样品中初筛获得的656株乳酸菌分别进行病原菌拮抗及细菌素活性检测，复筛获得1株高性能植物乳杆菌，混拌饲料投喂后，博氏沼虾存活率提高30.07%，比生长速率提高73.85%，虾体增重提高42.09%，饲料转化率由2.99%降至1.66%。Ana等[47]从鲈鱼体内初筛获得122株菌株，通过病原菌拮抗、胆盐及酸碱耐受实验，选定1株高活性粪肠菌，该菌能够激活多种促炎和抗炎细胞因子，有效调节鲈鱼非特异性免疫。Sunish等[48]利用实验室保藏的6株海洋放线菌进行抗哈维氏弧菌拮抗实验，获得放线菌发酵上清液后，按10%比例加入哈维氏弧菌培养体系中，弧菌生长抑制率可达52.4%。郑军荣等[49]从凡纳滨对虾肠道中筛得芽胞杆菌、酵母菌和肠球菌等7株菌株，发现其中的啤酒酵母、短小芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、暹罗芽胞杆菌，对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等致病菌具有良好的拮抗效果，暹罗芽胞杆菌抑菌活性最佳。除以上利用自然环境筛选，部分研究人员还将菌株进行了定向诱变，获得了新型菌株。例如，Zhou等[50]利用常温等离子体技术(ARTP)以及亚硝基胍(NTG)方法诱变解淀粉芽胞杆菌X030，结果显示，经诱变后的解淀粉芽胞杆菌对致病菌嗜水气单胞菌和维罗气单胞菌抗性增强。在活体养殖实验中，分别感染嗜水气单胞菌和维罗气单胞菌的草鱼死亡率分别降低52.9%和150%。总体来说，围绕病原微生物拮抗、产酶活性、胆盐耐受及酸碱耐受等特性，通过动物体内或养殖环境筛选依然是选育优良益生菌的有效手段，但选育菌株的低温耐受性往往同样重要，在发酵优化有效活菌数及产物活性等方面仍有较大提升空间。虽然基因工程改造或诱变在微生态制剂方面应用较少，但对生物生长存活仍具有显著作用，但需考虑改造后的菌株的生物耐受性。

3.2 发酵条件优化

事实上，优良益生菌菌种及有效活菌数(或孢子数)是微生态制剂的核心，高密度细胞发酵优化是获得高浓度有效活菌及活性代谢产物的有效途径。相关研究结果表明，经过发酵优化的制剂对水体净化能力以及养殖调节作用明显增强。李卓伟等[51]通过正交试验优化枯草芽胞杆菌发酵条件，在1.0%玉米粉、1.5%黄豆饼粉、0.2%MgSO4·7H2O、0.3%K2HPO4、0.1%KH2PO4、初始pH 7.0、8%(体积分数，下同)接种量、200 r/min培养条件下，39 ℃发酵培养48 h后产孢率达89.6%。元福杰等[52]通过单因素和正交试验，优化了枯草芽胞杆菌发酵培养基配方，在2.5 g/L葡萄糖、20 g/L豆粕、10 g/L NaCl、初始pH 7.5、170 r/min、5%接种量优化条件下，28 ℃发酵培养32 h最高有效活菌数达到8.5×109cfu/mL，产孢率高达91%。董春光[53]利用单因子试验和正交试验，优化了枯草芽胞杆菌培养基配方，在10 g/L玉米粉、10 g/L马铃薯淀粉、15 g/L豆粕粉、3 g/L Na2HPO4、3 g/L NaH2PO4、0.5 g/L MnSO4、初始pH 7.2～7.5、140 r/min、7%接种量优化条件下，37 ℃发酵培养12 h获得有效活菌数高达2.72×1011cfu/mL，制剂使用后，水体中亚硝酸盐、硝酸盐含量降低30.43%和46.62%，海参肠道内淀粉酶和蛋白酶活性分别提高了30.27%和59.50%。张倩[54]利用49株芽胞杆菌分别进行除氮和弧菌拮抗实验，筛选出FS017和FS037两株优良菌株，单因素和响应面实验结果显示，菌株FS017在24.38 g/L酵母膏、0.31 g/L FeSO4·7H2O、2.62%接种量优化条件下，有效活菌数最高为1.19×1010cfu/mL，抑菌圈直径达到25.04 mm；菌株FS037在最优发酵条件下，抑菌圈直径可达27.67 mm，弧菌拮抗效果明显。王晓飞等[55]将2%糖蜜作为碳源、0.5%酵母粉作为氮源，20 ℃、140 r/min，50 mL/250 mL装液量、初始pH 3.0的优化条件下，南极红酵母AN5发酵有效活菌数为5.81×107cfu/mL，应用于海参养殖后，参体蛋白和多糖含量分别提高了21.18%和23.63%。李钢平等[56]对解淀粉芽胞杆菌进行发酵优化，通过单因素和正交优化试验，发现在20 g/L蛋白胨、10 g/L玉米粉、20 g/L大米蛋白粉和1.0 mmol/L Mn2+优化条件下，发酵48 h后的孢子浓度达到7.0×109cfu/mL，较实验室LB培养基使用效果提高了3.3倍，比工业生产培养基使用效果提高了2.2倍。

传统发酵优化策略大多应用于芽胞杆菌、酵母菌等单菌的批次发酵过程调控，包括接种量、温度及pH、溶氧、营养组成及含量等。事实上，这些发酵营养组分往往较为复杂，常以豆粕、淀粉、葡萄糖、无机盐、促生因子等为主，发酵优化有效活菌数与生产强度仍有一定提升空间。因此，在批次发酵基础上采用分批补料发酵，定期向发酵体系补充水、氮源、碳源、无机盐等营养物质，以补充菌体生长繁殖消耗的营养物质。陈鸿图等[57]研究发现，在枯草芽胞杆菌批次发酵实验中，分别在11、18和24 h补加10 g/L玉米粉和7.5 g/L豆粕粉，发酵生产强度提高了112%。此外，钱风光等[58]利用枯草芽胞杆菌分别进行批次发酵和分批补料发酵，探究营养组成及发酵方式对发酵生物量的影响，研究发现将氮源豆粕浓度优化为4%时，批次发酵生物量可达8.2×109cfu/mL；与此同时，当发酵糖浓度降至10 g/L以下时，分两次各补加20 g/L糖，发酵生物量进一步提高到2.8×1010cfu/mL，因而调节发酵初始及过程碳氮比更有利于提高生物量。

为了进一步提高生产强度，需要考虑不同饲用益生菌之间、不同活性代谢产物之间的协同互作效应，应在“物质-能量-氧化还原”等细胞全局水平上，基于多维度协同互作机制，强化鱼虾、海参等水产养殖过程中饲料转化利用、促生防病治病、机体免疫调节、环境水质净化等方面的功能协同性与互补性。因此，开发混合菌株发酵工艺，制备复合微生态制剂，能够提升有效活菌数(或孢子数)及发酵生产强度，增强制剂生物效价及应用效果，提高生产设备利用率，减少操作环节与资金投入，降低制剂生产成本，具有研究意义和一定的应用价值。

3.3 混合菌株发酵及制剂应用

关于混合菌株发酵及其复合微生态制剂应用的研究报道较少，混菌发酵有效活菌数及生产强度能够较单菌发酵效果更佳。针对芽胞杆菌单菌发酵，吉沐祥等[59]在授权专利中公开了一种多粘类芽胞杆菌JX-13及其应用方法，培养基主要包括豆粕、马铃薯淀粉、蔗糖、酵母粉、碳酸钙以及硫酸锰，发酵控制溶氧100%、转速350 r/min、pH 7.0～7.2、30 ℃发酵36 h后，所制备的多粘类芽胞杆菌单菌制剂中有效活菌数为1×1010cfu/g。孙静等[60]以豆粕为底物，对坚强芽胞杆菌PC024发酵工艺条件进行了优化，围绕接种量、料水比、发酵时间、发酵温度进行响应面分析，发酵100 h后，制备的坚强芽胞杆菌单菌制剂中有效活菌数为1.23×1010cfu/g。相较而言，针对多粘类芽胞杆菌和坚强芽胞杆菌混菌发酵，薛闯等[61]在授权专利中公开了一种多粘类芽胞杆菌与坚强芽胞杆菌高密度混合发酵方式，发酵条件为通气量1.5～3 vvm(通气率)、溶氧30%～50%、转速150～200 r/min、pH 7.0～7.8、温度28～37 ℃，当葡萄糖浓度降至2 g/L时，通过流加补料维持糖浓度不高于2 g/L，发酵仅需13 h，发酵液中多粘类芽胞杆菌有效活菌数高达1.2～1.5×1010cfu/mL，坚强芽胞杆菌有效活菌数高达8.0～9.0×109cfu/mL，混菌发酵生产强度显著提高，制备的混菌制剂中有效活菌数高达为3 .0～6 .6×1011cfu/g，远高于上述单菌发酵制剂。而更为重要的是，多粘类芽胞杆菌与坚强芽胞杆菌具有显著的协同促生及抑菌作用，若作为复合菌剂生产，可减少工艺操作环节、生产设备与资金投入，生产经济性较好。

此外，优化组合复合菌剂也较单一菌剂具有更好的应用效果。Zhang等[62]利用从对虾中筛分出的植物乳杆菌、酿酒酵母和安全芽胞杆菌按1∶3∶3混合比例发酵制剂，与单一菌株制剂的使用效果相比，虾体总氨基酸含量提升14.63%，存活率为93.5%，体重增率达到687.63%。Meidong等[63]利用空气芽胞杆菌和植物乳杆菌，按 1∶1(质量比)混合比例发酵制剂饲喂鲶鱼幼鱼，与单一空气芽胞杆菌或植物乳杆菌制剂使用效果相比，幼鱼增重量分别提高了59.09%及103.06%，饲料转化率分别提高了101.92%及62.79%。张盛静等[64]研究发现，枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌按1∶1比例混合发酵制剂，饲喂被副溶血弧菌侵染的对虾，与单一枯草芽胞杆菌或地衣芽胞杆菌制剂效果相比，对虾死亡率分别降低11.43%和6.07%，特异性免疫应答能力分别提高了40.01%和16.69%。谢航[65]以实验室保存的耐盐荚膜红假单胞菌为基础，结合1株能高效降解残留饲料蛋白和淀粉的地衣芽胞杆菌、1株具有降解氨氮功能的假丝酵母，进行混合菌株发酵优化，当地衣芽胞杆菌、假丝酵母、耐盐荚膜红假单胞菌混合接种比例为4∶3∶3时，三者有效活菌数菌达到最高，分别为2.69×108cfu/mL、4.07×107cfu/mL和6.03×109cfu/mL，同时发现假丝酵母与耐盐荚膜红假单胞菌具有明显的协同互作关系。李静舒等[66]利用凝结芽胞杆菌和嗜热链球菌，通过单因素试验和正交试验发现凝结芽胞杆菌和嗜热链球菌体积比按2∶1(体积比)混合，以4%接种量，43 ℃发酵有效活菌数为1.767×109cfu/mL，抑菌作用接近12.5 mg/L硫酸卡那霉素。王宇翕等[67]利用3株乳酸菌、2株芽胞杆菌、1株酵母菌，按等比例混合发酵制备复合微生态制剂，较单一菌株发酵，混合菌株发酵有效活菌数提高了2倍，同时对水体氨氮的清除能力提高了40.1%。王莹等[68]将克雷伯氏菌和枯草芽胞杆菌按2∶1(质量比)比例混合发酵，投放罗氏沼虾养殖水体中，环境氨氮、亚硝酸盐和硫化氢降解率分别提高至43.59%、37.96%及18.80%，推测红螺菌、乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌和克雷伯氏菌混合发酵过程存在种间拮抗效应。总体来说，上述混合菌株发酵制剂的应用效果较为单一，一类用于提高鱼虾养殖存活率与饲料转化率，促进生长与增重，改善肉质营养组成；一类用于降解养殖水体中的饲料残渣、动物排泄物等大分子有机物，减少氨氮、亚硝酸盐等毒害物质积累，起到净化水质的作用。因而，基于益生菌协同互作机制的多效复合型微生态制剂开发是未来研究工作的重点。

4 展 望

我国水产资源丰富，养殖规模及密度日益扩大, 为了防控水产养殖病害的发生, 抗生素等化学药物的使用起到了一定的积极作用。但是，由于抗生素长期使用和滥用，病原微生物产生抗药性，导致抗生素用量增加，引发水产动物内源性感染和二重感染，破坏和干扰了动物肠道正常菌群和养殖微生态环境，甚至降低了机体免疫应答反应，更直接危害人类健康。因此，水产养殖业必须走可持续发展的健康、绿色、高效种养殖道路，生产绿色无公害水产品。微生态制剂作为水产养殖饲料添加剂，是理想的抗生素替代品，具有绿色环保、无毒副作用、无残留污染、不产生抗性、作用范围广等优点，能够调节动物肠道微环境，增强机体免疫力，促进生长发育，提高养殖产能与经济效益，同时还起到净化环境水质，降低营养氮素累积的作用，环保及可持续发展效益十分显著，发展空间及市场容量巨大。饲用微生态制剂在鱼虾、海参养殖应用方面仍存在问题与挑战，未来研究重点在于开发成套集成技术，包括高效益生菌选育技术，增强生长定殖、代谢合成以及产物表达能力，以提高在动物体内及水体环境中的生物效价；高效发酵制剂技术，提高发酵有效活菌数、代谢产物浓度，缩短发酵生产周期；基于协同互作机制的混合菌株发酵技术，增强益生菌功能互补，提高生产设备利用率。通过上述技术的优化集成，可以有效提高微生态制剂的生物效价及应用效果，积极发挥重要的“减抗、替抗”作用，同时降低发酵生产的资本投入和运营成本，助推高效种养殖、绿色安全及环境友好型模式的高质量可持续发展。