根际微生物组组装与植物健康

崔中利， 叶现丰， 张 宇， 徐昌盛， 李周坤， 黄 彦， 曹 慧

(1.南京农业大学生命科学学院/农业农村部农业环境微生物重点实验室，江苏 南京 210095；2.南京农业大学 生物互作与作物健康重点实验室，江苏 南京 210095)

微生物在地球上广泛分布[1]，其在全球生物量中的比例仅次于植物[2]。土壤作为陆生生态系统的物质载体[3]，拥有最多样化和最复杂的微生物群落，每克土壤中微生物来源生物量碳的含量超过0.5 mg，微生物物种超过50 000种[2-4]。土壤微生物通过分解和合成有机物参与全球碳氮磷及其他元素的循环，通过互利共生或共栖等方式定殖于植物根部形成结构复杂的根际微生物群落从而影响植物营养吸收和健康[4]，因此，根际微生物组又被称为植物的“第二基因组(second genome)”或“扩展基因型(extended genotype)”[2]。植物与微生物之间的互作是十分复杂的。植物能通过根际分泌物和免疫系统调节根际微生物组组成，而根际微生物通过代谢活动参与植物的发育、养分吸收和胁迫响应等诸多过程[5-6]。尽管越来越多的根际微生物被报道具有用作生防菌剂和土壤调节剂的潜力，但土壤中微生物与微生物、微生物与植物之间的互作机制仍不清楚[7]。因此阐明根际微生物与宿主植物及微生物之间的互作机制，对利用根际有益微生物发展可持续农业具有重要意义。而根际微生物群落的组装结果除了受植物的影响外，还受外界环境和农艺管理措施的影响[8]。由于温度和降雨等环境变化为不可控因素，因此，本文主要通过近十年的相关研究讨论农艺管理，宿主植物及微生物之间的互作对土壤微生物群落组装的影响，以及根际微生物组如何影响宿主植物健康。

1 农艺管理对土壤微生物群落的改变

由于土壤微生物群落受土壤湿度、透气度、pH、营养及耕作模式等因素影响[9]，因此，包含机械翻耕、无机及有机肥料的使用、化学药剂及作物轮作等在内的农艺生产管理措施对土壤中微生物群落的影响较大。研究表明农艺管理对土壤微生物生物量和多样性的影响是长期动态的，但其在短期内能够直接抑制或刺激某些微生物的生物学过程，表现为土壤中总酶活力的改变，该过程也被称为农艺管理的“副作用(side effect)”[10]。

1.1 肥料使用

农艺管理中使用的肥料主要分为无机肥料和有机肥料。Zhou等[11]研究表明无机肥料尤其是氮肥的使用能够显著降低土壤微生物群落的α-多样性，但磷肥对微生物群落α-多样性的影响较小。无机肥料对土壤微生物的影响主要与肥料使用后土壤pH的改变和直接的营养引入有关。土壤pH酸化对微生物群落的影响要显著大于直接营养引入对微生物群落的改变[12]。土壤中微生物生物量分析显示，在未开垦的土地中施用氮肥能够导致微生物生物量降低5.8%～15%左右[13]。

相比于无机肥料，长期施用有机肥料能够显著增加土壤微生物生物量和多样性，增加酸杆菌门和厚壁菌门等分类水平上微生物的相对丰度[14]。如研究人员发现施用动物粪便的土壤中，微生物生物量相比施用无机肥料增加了36%～40%[15]。此外，有机物料的使用能够调控土壤中碳氮比，增加土壤中固氮微生物的相对丰度和固氮酶活性[16]。利用有益微生物制备的生物有机改良剂也能有效调控土壤微生物群落结构[17]，如利用芽胞杆菌进行固体发酵生产的生物菌肥能够通过调控轮作土壤中微生物群落结构，使其恢复正常，从而有效降低香蕉枯萎病的发生[17]。

1.2 作物轮作

农作物主要通过根际分泌物、植物残体和共生体改变土壤中碳元素输入、营养成分及土壤结构，并直接或间接改变土壤中微生物群落结构[18]。轮作被认为是一种减少土壤中植物病原菌数量和降低植物发病率的有效途径[10]。得益于和豆科植物共生微生物的固氮作用及其本身较高的含氮量，豆科植物能够有效改善土壤中碳氮比，因此，和豆科作物之间的轮作被认为是轮作的最佳选择[19]。如Murugan等[19]发现和豆科作物轮作的土壤能够显著增加真菌的生物量及真菌和细菌比值，但Tiemann等[20]却得出相反的结论，研究者发现真菌和细菌之间的比值和轮作作物的多样性指数呈显著负相关。Ai等[18]发现在小麦-玉米向小麦-大豆轮作体系的转变中，真菌的响应更活跃，其中粪壳菌纲中的部分科水平上微生物的相对丰度显著增加3倍以上。

1.3 耕作方式和化学药剂的使用

耕作方式主要通过改变土壤湿度、通气量和土壤密度来影响土壤微生物群落[10]。研究表明，和免耕相比，表层土强烈的机械翻耕会导致土壤微生物生物量和酶活的降低[21]，但由于免耕或少耕导致的土壤水分含量过高会引起土壤板结，并最终导致土壤中反硝化微生物丰度上升和反硝化作用增强[22]。农业生产中常用的化学药剂主要包括除草剂、杀虫杀菌剂等。杀虫剂的使用不仅能显著降低土壤微生物群落多样性和微生物生物量，甚至影响土壤酶活性[23]。杀菌剂仍是目前解决植物真菌病害的主要方法。在农艺管理中杀菌剂的使用不仅抑制或杀灭植物病原真菌，还会影响土壤中腐生真菌的生长[23]。研究表明铜离子杀菌剂的过量使用导致土壤中铜离子的富集会显著降低土壤微生物多样性和微生物生物量[12]。

2 植物对土壤微生物群落的调控

在植物-微生物互作中，根际微生物群落结构不仅受农艺管理方式和环境的影响，而且受植物类型和生长时期的影响。植物对微生物群落的调控主要通过根际分泌物的作用。根际分泌物占植物总光合作用固定碳的5%～44%，总植物氮的15%左右，包含多种初级及次级代谢产物，如糖、有机酸、氨基酸和萜类物质等[24-25]。这些初级及次级代谢产物被植物分泌到土壤招募特定种类的微生物定殖于植物根部，实现植物抵御生物及非生物胁迫，该过程也被称为“cry for help”策略[5,26]。如Zhong等[27]首次从葫芦科植物中鉴定到葫芦素B的转运蛋白MATE，在该转运蛋白的作用下葫芦素B被分泌到根际土中并促进肠杆菌的生长，而肠杆菌又可促进植物根际芽胞杆菌的生长繁殖从而抑制镰刀菌对植物的侵染。

2.1 植物生长代谢对根际微生物组装的选择作用

植物产生并分泌到土壤中的各种代谢产物在微生物到达和面对植物免疫反应之前就会影响根际微生物群落的组装[28]。同时根际分泌物因植物种类、基因型和发育时期而不同，并造成根际微生物群落结构的显著不同[29]。研究者分析19种基因型的拟南芥根际分泌物，发现其根际分泌物组成，尤其是芥子油甙、苯丙素类和黄酮类化合物的成分因基因型不同而显著差异[30]。这些化合物也是造成不同基因型拟南芥在根部组装特异微生物群落的关键因素。研究者利用多组学相结合手段证明植物在不同生长发育阶段组装特定的根际微生物组，达到富集特定微生物功能的目的[31]。如相同基因型的拟南芥在幼苗、营养、抽薹和开花期根际分泌物组分，尤其是氨基酸、酚类、糖和糖醇类化合物含量存在显著差异，这也是造成不同生长期拟南芥根际土中放线菌门、拟杆菌门和蓝细菌相对丰度显著差异的主要原因[32]。

植物对营养匮乏的防御反应也能改变根际微生物群落组成。随着植物中越来越多与营养吸收或转运相关的基因或蛋白被鉴定，植物通过招募根际微生物参与植物营养吸收的机制逐渐被解析。如NRT1.1B是造成亚洲籼稻和粳稻的氮素利用效率差异的主要原因，NRT1.1不仅运输硝酸盐，而且能促进根系吸收植物激素类物质，从而影响侧根的发育[26,33]。和NRT1.1B突变株相比，野生型菌株根部有更多微生物参与土壤中氮素循环。NRT1.1B与土壤中参与氨化过程的根际细菌的相对丰度有关，这些微生物能催化根际环境中铵离子的形成，从而促进植物对氮的获取[6]。豆科植物能够从根际土中招募固氮微生物形成共生体系促进植物对氮素的吸收利用。研究人员向土壤中接种的外源根瘤菌不仅促进了植物的生长，而且改变了大豆的核心微生物群，增强了根际微生物群落之间的关联性[34]。

2.2 生物胁迫影响植物对根际微生物组的组装

植物在整个生长周期中会受到病原体侵染或昆虫取食等各种生物胁迫的威胁，并逐渐驯化出相应的抗性机制[26,35]。其策略之一是植物在受到生物胁迫后通过改变根际微生物群落以达到增强胁迫抗性的目的。Ye等[36]在进行黄瓜枯萎病的防控实验中发现，向黄瓜根部接种黏细菌生防菌剂后，黏细菌EGB能够调控黄瓜根部土壤微生物群落，显著增加溶杆菌、黄杆菌、芽胞杆菌和放线菌等属微生物的相对丰度，从而防控镰刀菌对黄瓜的侵染。拟南芥叶片在被丁香假单胞菌侵染后诱导根际分泌物中的苹果酸的含量显著上升，招募枯草芽胞杆菌触发植物免疫反应抵御丁香假单胞菌的侵染[37]。

植物根际分泌物中除糖、氨基酸或糖醇等化合物外，香豆素类、苯并噁嗪类和三萜类化合物在根际分泌物调控微生物群落中起着关键作用[7]。在植物体内香豆素类化合物主要通过苯丙素类化合物合成途径合成[38]，主要包括秦皮甲/乙素(esculin/esculetin)[39]、东莨菪素(scopoletin)[39]、秦皮素(fraxetin)[39]和香豆素(coumarin)[38]等。香豆素类化合物不仅被证明与植物铁吸收有关[40]，还被证明与植物对微生物群落调控、诱导植物产生系统抗性和抵御病原菌侵染直接相关[38,41]。拟南芥中东莨菪素的产生与分泌受根特异性转录因子MYB72和β-葡萄糖苷酶基因BGLU42的调控[38]。和野生型植株相比，myb72、bglu42突变株及东莨菪素的合成基因f6′h1突变株根部的变形菌门微生物相对丰度显著增加，厚壁菌门微生物的相对丰度显著降低[38]。

相比其他植物，苯并噁嗪类化合物在玉米根际分泌物中含量较高，具有吸引根际有益微生物和帮助植物防御病原菌入侵的作用[42]。最近，研究人员发现苯并噁嗪类化合物能改变根际细菌和真菌群落的组装方式，而且作为“遗产”能够显著影响下茬玉米根际微生物群落，诱导变形菌门和球囊菌门微生物在根际富集[43]。三萜类化合物是根际分泌物中另一类能够改变微生物群落结构，招募有益微生物定殖于根部增强植物抗病的化合物[27,44]。如拟南芥宁素(thalianin)和拟南芥啶素(arabidin)基因缺失突变株根部δ-变形菌门的微生物相对丰度显著下降，而拟杆菌门的相对丰度显著上升[44]。

2.3 非生物胁迫对根际微生物组的影响

植物在生长环境中不仅面临昆虫取食和病原菌侵染等生物胁迫，还会面临高盐、干旱、重金属污染和营养缺乏等环境带来的非生物胁迫[45-46]。面临非生物胁迫，植物同样能通过根际分泌物的改变招募特殊种类的微生物帮助植物增强胁迫抗性。如前所述，植物在缺铁环境中能通过分泌香豆素类化合物增加土壤中可利用铁含量，促进植物对铁元素的吸收，而在此过程中香豆素类化合物的分泌能改变土壤微生物群落，增加放线菌门微生物的相对丰度[45,47]。植物来源MATE家族转运蛋白能转运多种次级代谢产物，如有机酸、植物激素和生物碱类，在植物抵御生物和非生物胁迫中起着重要作用[27,48]。研究人员发现大豆在高铝胁迫下，GmMATE58和GmMATE1基因的表达增加，促进大豆根际分泌物中苹果酸、草酸和酚类化合物的分泌，招募根际中的有益微生物，如伯克霍尔德属微生物的相对丰度升高[49]，增强大豆对铝胁迫的抗性[50]。拟南芥在高盐胁迫下，植物内生细菌肠杆菌SA187在拟南芥根部定殖并通过2-酮-4-甲基硫代丁酸(2-keto-4-methlthiobutyric acid, KMBA)激活拟南芥乙烯信号通路增强拟南芥耐盐[51]。

3 根际微生物组装促进植物生长和抗病

现代农业在不断提高农作物产量的同时，更注重农产品的质量。植物有益微生物与植物互作的研究及其在农业生产中的应用为化肥和农药减施，实现农业可持续发展提供了可能[29]。如根际微生物通过初级或次级代谢产物增加土壤中可用养分的释放促进植物营养吸收，通过对病原菌生长抑制或诱导植物系统抗性增强植物抗病能力[38]，最终实现促进植物生长和增产。因此，具有特定功能的微生物的筛选及根际微生物对植物功能基因或表型的“自下而上”的调节机制的研究具有重要意义。

3.1 根际微生物促进植物生长

随着宏基因组学的发展，根际微生物与植物在分子层面的互作机制逐渐被揭示。根际微生物通过分泌次级代谢产物增加土壤中可利用磷或铁的含量[52]、产生吲哚-3-乙酸(IAA)[53]或具有促生作用的挥发性化合物[54]、生物固氮[55]、上调或下调植物体内与生长相关基因促进植物的生长。如磷是植物生长必须的营养元素，根际微生物对土壤中磷矿化对促进植物生长具有重要意义。研究者从小麦根际土中分离到的5株放线菌通过分泌苹果酸和植酸酶等直接参与土壤中磷溶解从而促进小麦的生长[52]。浅黄假单胞菌(Pseudomonasluteola)和芽胞杆菌属(Bacillusspp.)微生物能通过协同作用增强溶磷效果促进龙舌兰的生长[56]。

相比于其他促生机制，微生物通过固氮作用和IAA产生促进植物生长的研究较早。生物固氮(biological nitrogen fixation，BNF)最经典的体系是根瘤菌-豆科植物共生体系，在可持续农业系统中根瘤菌也被认为是替代化学氮肥最有潜力的菌剂[55]。研究发现土壤中外源根瘤菌的接种不仅促进大豆植株的生长，也能改变大豆核心微生物群落，增加根际微生物之间的联系[34]。除根瘤菌外，具有固氮作用的根际细菌对植物的促生作用也被广泛报道，如小麦根际细菌PseudomonasprotegensPf-5 X940 和PseudomonasstutzeriA1501的使用能显著增加小麦和玉米的产量[57]。微生物来源生长素是其促生的一种重要机制。到目前为止，从革兰阳性和阴性细菌中分别鉴定到4条和5条IAA的合成途径[53]。如解淀粉芽胞杆菌SQR9基因组中含有完整的IPyA合成途径基因[58]。

挥发性化合物(volatile organic compounds，VOC)是一类具有低分子量(<300 Da)、高蒸汽压和低沸点的化合物，能广泛产生于真菌和细菌，如芽胞杆菌属，珊瑚球菌属和毛壳菌属等[59-60]。微生物来源挥发性化合物被广泛报道应用于拮抗真菌和促进植物生长，如珊瑚球菌属黏细菌EGB来源异辛醇在较低浓度下能完全抑制尖孢镰刀菌和指状青霉孢子的萌发和菌丝生长[60]。黄绿蜜环菌(Floccularialuteovirens)产生的挥发性化合物能通过抑制生长素外排载体PIN2蛋白的相对丰度增加生长素在植物体内积累从而达到减少主根生长和增加侧根数量的目的[54]。此外，研究者通过转录组分析发现，黄绿蜜环菌来源的VOC能通过调节与碳/氮代谢和抗氧化相关基因的转录水平显著增加拟南芥地上部分的生物量[54]。

3.2 根际微生物诱导植物产生系统抗性

根际微生物除了通过分泌抗菌化合物直接抑制植物病原真菌外，还能通过分泌次级代谢产物或利用自身组分等让植物产生对病原菌的抗性[29,61]。可诱导的植物抗性包括病原菌激发的系统获得性抗性(pathogen-triggered systemic acquired resistance，SAR)和非病原菌诱导的系统抗性(nonpathogenic microbes-induced systemic resistance，ISR)[62]。尽管SAR和ISR途径中部分响应蛋白是相同的，但两种途径的激发子和调控途径是不同的[61-62]。其中植物细胞内ISR途径中模式识别受体(pattern recognition receptors，PPR)识别的微生物相关模式分子(Microbe-associated molecular patterns，MAMP)主要为细菌的鞭毛和脂多糖等[63]及真菌细胞壁中的几丁质和葡聚寡糖等[64-65]。这里我们仅仅讨论由根际非病原微生物与植物互作产生的诱导系统抗性在植物抗病中的作用。

1991年Van Peer等[66]在植物抗病实验中将生防细菌和病原菌分开接种从而避免了生防菌和病原菌接触导致的对病原菌的直接拮抗作用，从而证实了由非致病菌诱导植物产生的系统抗性。荧光假单胞菌WCS417r接种到康乃馨根部时，能显著增加植物对土传真菌病原菌尖孢镰刀菌的抗性，并促进植物抗毒素在病原菌感染部位的积累[66]。后来，研究者发现荧光假单胞菌WCS417能够通过分泌小分子化合物抑制鞭毛诱导的植物对自身的免疫响应，但这种免疫信号级联被系统地启动赋予植株对病原菌甚至昆虫的广谱抗性[67-68]。除荧光假单胞菌对植物的诱导系统抗性研究较清楚外，还有丛枝菌根真菌、芽胞杆菌属、木霉属等PGPR(plant growthpromoting rhizobacteria)被报道能够诱导植物系统抗性[69]。如在蒺藜苜蓿根部接种丛枝菌根真菌能显著增加植物对黄单胞菌的抗性[69]。此外，研究者发现植物体内R2R3型MYB转录因子MYB72及其调控的β-葡萄糖苷酶BGLU42除了能促进植物在缺铁环境中对铁离子的吸收及调控植物根际分泌物的分泌外，也参与调控PGPR触发的诱导系统抗性[38,70]。

4 人工合成微生物群落促进微生物-植物互作研究

根际微生物组的研究主要包含基于纯培养依赖和非依赖以及基于还原主义构建合成微生物群落(Synthetic community，SynCom)三种方法[5]。相比于前两种，SynCom方法除了能在土壤湿度、温度和营养等环境可控条件下研究群落组成与功能外，还能通过替换、添加或去除某种微生物分析单一菌株在群落中的功能。微生物的分离鉴定是构建SynCom的基础，Bai等[71]和Zhang等[6]建立的细菌高通量分离鉴定技术为此提供了可能。Zhang等[6]利用Illumina HiSeq2500提高测序深度，并通过序列双端标记避免嵌合体的形成，成功从水稻根部鉴定到13 512株细菌分离株，大约覆盖了70%的可培养细菌。

大量根际细菌分离株的鉴定让研究者从整体角度理解植物微生物群落组成和变化[5, 72]。基于这些细菌分离株遗传学信息构建的各种具有代表性的SynCom，让研究者能在可控条件下研究植物与微生物群落之间的相互作用，解析植物驱动微生物群落组装的因素，阐明根际微生物组在植物生长发育过程中的调控功能及分子机制[72-73]。如在进行植物对微生物群落定殖选择性研究时，研究者分别从百脉根和拟南芥共有的16个科的根际微生物分离株中分别选取独有的16个属的细菌分离株合成由32株细菌分离株组成的SynCom。在用SynCom分别接种百脉根和拟南芥后，研究者发现初始来源于拟南芥的微生物在拟南芥根部显著富集并定殖，并且相似的现象也出现在百脉根上。结合植物转录组分析，研究者发现宿主对根际微生物定殖的选择性主要由植物免疫调节因子、MAMP受体激酶和乙烯响应因子决定[74]。反之，根际微生物也通过MAMP参与植物免疫调节(MAMP-triggered immunity，MTI)[75]。Teixeira等[75]从拟南芥根部鉴定到多株能强烈抑制MTI的细菌分离株，这些分离株无论是单菌株还是SynCom均能选择性抑制包括受体和转录因子等在内的关键免疫基因，从而增加其他细菌在拟南芥根部的稳定定殖。

SynCom同样能被用来研究微生物与微生物之间的相互作用。如Niu等[76]利用从玉米根部分离的7株具有代表性的细菌分离株构建简单的SynCom研究植物及微生物之间互作过程对群落组装的影响，结果显示Enterobactercloacae从SynCom中去除能直接导致SynCom的崩溃，说明了Enterobactercloacae在群落组装中的关键作用。Carlström等[77]用62株细菌分离株构建SynCom，以研究菌株在植物根际的定殖顺序对群落结构的影响，研究人员从SynCom中去除一株或多株细菌分离株能显著改变微生物群落结构，但向稳定的SynCom中添加移除的菌株并不能显著改变群落的结构，该效应被称为细菌定殖的优先效应。尽管SynCom极大促进了微生物与微生物、微生物与植物互作研究，但由于SynCom的复杂性远远小于自然土壤群落，导致了微生物群落中可能的重要成员的缺失和自然条件下复杂微生物群落互作的不可重复[29]。

5 展 望

解析微生物与植物及微生物与微生物之间的互作机制，对利用根际微生物促进植物健康、增加作物产量、实现农业可持续发展具有重要意义。本文重点总结了农艺管理措施，植物生长过程中生物和非生物胁迫对根际微生物群落组装方式的改变，以及根际微生物与植物互作对植物健康的影响。大量的研究结果证明了植物根际微生物在促进植物生长和抗病方面的重要性，并揭示了根际微生物与植物之间的复杂联系。除此之外，包括宏基因组和代谢组在内的多组学技术极大促进了研究者对植物与微生物互作机制的研究与理解，基于还原主义的SynCom为我们解析根际微生物组的功能扩展了思路。但自然土壤微生物群落结构的高度复杂性和自然环境不可控因素仍是阻碍我们对土壤微生物定殖、微生物与植物互作研究最主要的因素。因此，未来的研究应该包括以下方向：①基于大数据分析将微生物表型与多种植物联系起来，分析不同植物根际微生物的特性与共性，解析产生原因；②开发更先进的技术和方法进行根际微生物的高通量分离鉴定，揭示根际微生物组装的复杂机制；③分析有益微生物长期使用对本地微生物群落组装及植物表型的影响。此外，我们应该重视理论到实践的转变，用已取得的成果指导农业的可持续发展。