牛源近平滑念珠菌对氟康唑耐药性研究

马文爽, 杜 军, 周学章

(宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021)

近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)是一种以酵母样细胞和假菌丝两种形态广泛存在于自然界，人和哺乳动物皮肤、黏膜表面，并且存在不同菌落形态转化的一类人畜共患条件致病菌[1]，最早在1928年由Ashford从波多黎各一位腹泻病人的粪便中分离得到[2]。念珠菌当中白色念珠菌是主要致病菌，但近十年来，近平滑念珠菌和克柔念珠菌等非白念珠菌在临床分离率逐渐提高。人医临床上，近平滑念珠菌在某些地区目前已经成为第二甚至第一的侵袭性致病念珠菌[3]；兽医临床上，根据本实验室前期对宁夏银川市奶牛场的真菌性乳房炎调查发现，近平滑念珠菌是仅次于克柔念珠菌的主要致病念珠菌[4]。近年来，随着广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂等药物以及侵入性临床检查或治疗应用的日益增多，人源近平滑念珠菌等非白念珠菌多重耐药性越来越严重，已成为目前临床上面临的焦点问题。以往人源近平滑念珠菌对临床常用的唑类药物多为敏感, 但是近年来耐氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑的近平滑念珠菌常常见诸报道[5]。已有研究报道表明，人源念珠菌的耐药性主要由编码羊毛甾醇14α-去甲基化酶(14α-demythylase, 14-DM)的ERG11基因产生突变或高表达，ABC 转运蛋白超家族(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)基因和易化扩散载体超家族(major facilitator super family, MFS)基因及其转录因子MRR1(multi-resistance regulator)的高表达所导致的。近平滑念珠菌药物外排泵包括ABC转运蛋白超家族的念珠菌药物耐药基因1(Candida Drug Resistance gene 1,CDR1)、念珠菌药物耐药基因2(Candida Drug Resistance gene 2,CDR2)和易化扩散载体超家族的多药耐药基因1(Multidrug resistance gene 1,MDR1)以及转录调节因子MRR1[6]。Berkow等[7]发现CDR1和MDR1的高表达与人源临床近平滑念珠菌分离株对唑类耐药性的产生有关。长期以来国内外兽医临床上的研究主要集中在念珠菌的分离鉴定、生物学活性、药物联用及开发上，对其耐药机制研究不深入。因此，本研究针对近平滑念珠菌耐药相关基因ERG11、MDR1、CDR1、MRR1进行研究，以了解其与宁夏银川市地区牛源近平滑念珠菌耐药性的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试菌株 近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)质控菌株ATCC22019购自美国模式培养物集存库；牛源近平滑念珠菌试验菌株分离自宁夏银川市患乳房炎奶牛的乳汁样品。

1.1.2 培养基 CHROM agar念珠菌显色培养基购自上海欣中生物工程有限公司；YPD液体培养基、改良沙堡弱琼脂培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 DN15-新型植物基因组DNA快速提取试剂盒、CV16-Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit、DH5α感受态细胞均购自北京艾德莱生物科技有限公司；2× Phanta Max Master Mix、HiScript III RT SuperMix、2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；RNAiso Reagent购自宝生物工程(大连)有限公司；氟康唑(FLC)、伊曲康唑(ITR)、酮康唑(KET)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、两性霉素B(AMB)均购自大连美仑生物技术有限公司。PCR反应仪(22331 Hamburg,德国Eppendorf公司);实时荧光定量PCR仪(QuantStudio 5,美国ABI公司)；核酸电泳系统(Universal Hood II,美国Bio-Rad公司);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。

1.2 方法

1.2.1 近平滑念珠菌分离株的鉴定 在改良沙堡弱琼脂培养基上培养并分离菌种，使用CHROM agar 念珠菌显色培养基进行初步筛选，以近平滑念珠菌质控菌株ATCC22019为参照，将筛选出的白至粉色菌落最终采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定。

1.2.2 体外药物敏感性试验 用灭菌蒸馏水将氟康唑溶解成128 mg/mL的储存液，采用DMSO将伊曲康唑、酮康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶分别溶解成1.6、1.6、3.2、12.8 mg/mL的储存液；参照CLSI M27-A3推荐的微量稀释法[8]，采用96孔板对试验菌株进行体外药物敏感性试验，从中筛选出氟康唑的耐药(R)、剂量依赖(SDD)及敏感(S)菌株。近平滑念珠菌耐药性的判断标准：氟康唑最小抑菌浓度(MIC)≤0.5 μg/mL为S，0.5～4 μg/mL为SDD，≥4 μg/mL为R；伊曲康唑MIC≤0.125 μg/mL为S，0.125～0.5 μg/mL为SDD，≥0.5 μg/mL为R；酮康唑MIC≤0.03 μg/mL为S，0.03～0.25 μg/mL为SDD，≥0.25 μg/mL为R；5-氟胞嘧啶MIC≤0.06 μg/mL为S，0.06～0.25 μg/mL为SDD，≥0.25 μg/mL为R；两性霉素B MIC≤0.25 μg/mL为S，0.25～2 μg/mL为SDD，≥2 μg/mL为R。

1.2.3ERG11基因突变检测 按照DN15-新型植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书，对在YPD培养基中培养12 h的近平滑念珠菌试验菌株和质控菌株ATCC22019提取基因组DNA。根据GenBank 数据库中登录号GQ302972为已知序列设定引物1对(表1)[9]。经回收纯化后的目的基因片段连接到CV16零背景平末端克隆载体上，然后转化到DH5α感受态细胞中，白色菌落经PCR检测后送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序。PCR反应参数: 第一阶段：94 ℃预变性3 min；第二阶段：变性95 ℃ 15 s、退火60 ℃ 15 s、延伸72 ℃ 60 s，共35次循环；第三阶段：72 ℃终延伸8 min；4 ℃保存。PCR反应体系总体积为25 μL，包括DNA 模版1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × Phanta Max Master Mix 12.5 μL，蒸馏水10.5 μL。

1.2.4ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因表达水平定量测定 按照RNAiso Reagent说明书的步骤对在YPD培养基中培养12 h的近平滑念珠菌试验菌株与质控菌株ATCC22019提取基因组RNA。根据GenBank 数据库中近平滑念珠菌ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因序列信息设计引物4对(表1)。按照HiScript III RT Super Mix试剂盒说明，将RNA反转录成cDNA，用4对引物对近平滑念珠菌ERG11、MDR1、CDR1、MRR1进行Realtime PCR扩增。Realtime PCR反应参数: 预变性：95 ℃ 3 min；循环反应：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40次循环；溶解曲线：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。Realtime PCR反应体系总体积为20 μL，包括cDNA模版1 μL，上下游引物各0.5 μL，2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，蒸馏水8 μL。收集荧光数据并使用QuantStudio设计分析软件1.3.1进行分析。

表1 近平滑念珠菌ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因引物Table 1 The primers for amplification of C.parapsilosis ERG11、MDR1、CDR1、MRR1 genes

1.2.5 统计学方法 数据使用 GraphPad Prism 8 进行统计分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 近平滑念珠菌分离株的鉴定结果

收集宁夏银川地区6个奶牛场中327份乳房炎临床乳汁样品，并在改良沙堡弱琼脂培养基上涂布培养，将在该培养基上正常生长的临床菌株接种至CHROM agar念珠菌显色培养基上培养，发现13株菌落呈白色略带粉色，初步鉴定为近平滑念珠菌，通过MALDI-TOFMS鉴定[10]，确定其中的12株为近平滑念珠菌(CP1～CP12)并做为试验菌株，1株为其他念珠菌。

2.2 药物敏感性试验结果

采用药敏试验检测5种临床常用抗真菌药物对12株牛源近平滑念珠菌试验菌株的MIC，以近平滑念珠菌ATCC22019作为质控菌株控制整个试验条件。药敏结果显示，12株试验菌株对氟康唑的敏感率为41.7%，对酮康唑敏感率为50%，对伊曲康唑敏感率为58.3%，对5-氟胞嘧啶的敏感率为75%，对两性霉素B敏感率为83.3%。12株试验菌株中有5株对氟康唑耐药，2株为剂量依赖，5株敏感。12株试验菌株对5-氟胞嘧啶、两性霉素B的敏感率均高于75%，对唑类药物的耐药率均高于50%，其中对氟康唑的耐药率最高，达58.3%(表2)。将12株试验菌株分为氟康唑耐药组、剂量依赖组和敏感组开展后续试验。

表2 近平滑念珠菌药敏试验结果Table 2 Results of antimicrobial susceptibility tests of C.parapsilosis isolates (n=12)

2.3 ERG11基因突变检测结果

对12株近平滑念珠菌试验菌株与近平滑念珠菌质控菌株ATCC22019基因组DNA中的ERG11基因进行双向测序。测序结果发现，与质控菌株ATCC22019相比，12株试验菌株中共检测到2个基因突变位点，12株试验菌株均检测到错义突变A395T，5株氟康唑耐药株和1株剂量依赖株检测到了同义突变T591C(表3)。说明同义突变T591C可能与近平滑念珠菌对氟康唑耐药性的产生有关。

表3 近平滑念珠菌ERG11基因突变结果Table 3 ERG11 gene point mutations in C.parapsilosis clinical isolates (n=12)

2.4 ERG11、MDR1、CDR1、MRR1基因表达水平结果

对获得的12株近平滑念珠菌试验菌株与质控菌株ATCC22019基因组RNA进行Realtime PCR扩增。统计分析实时荧光定量PCR试验获得的数据显示，氟康唑耐药组ERG11基因表达水平显著高于剂量依赖组和敏感组(P=0.000 7和P=0.001 9)，有统计学意义；氟康唑耐药组CDR1基因表达水平显著高于敏感组(P=0.003 6)，与剂量依赖组表达水平差异无统计学意义；氟康唑耐药组MDR1基因表达水平显著高于剂量依赖组和敏感组(P<0.000 1和P=0.000 3)，有统计学意义；氟康唑耐药组MRR1基因表达水平显著高于剂量依赖组和敏感组(P<0.000 1和P=0.002 4)，有统计学意义(图1～4)。说明ERG11、CDR1、MDR1、MRR1基因的高表达可能在牛源近平滑念珠菌对氟康唑耐药性的产生中起到一定的作用。

图1 近平滑念珠菌ERG11 mRNA的表达量(A)和ERG11 基因在氟康唑耐药组、剂量依赖组和敏感组的表达量(B)Fig.1 Expression amount of ERG11 mRNA in C.parapsilosis isolates(A) and Expression amount of ERG11 mRNA in three groups of C.parapsilosis clinical isolates(B)NS表示与阴性对照相比无统计学意义，*表示与阴性对照相比差异显著(P<0.05)，**表示与阴性对照相比差异极显著(P<0.01)，***表示与阴性对照相比差异极显著(P<0.001)，****表示与阴性对照相比差异极显著(P<0.000 1)(下同)NS indicates no statistical significance compared with negative control, * indicated significant difference compared with negative control (P<0.05), ** indicated extremely significant difference compared with negative control (P<0.01), *** indicated extremely significant difference compared with negative control (P<0.001), **** indicated extremely significant difference compared with negative control (P<0.000 1)(The same follow)

图2 近平滑念珠菌CDR1 mRNA的表达量(A)和CDR1基因在氟康唑耐药组、剂量依赖组和敏感组的表达量(B)Fig.2 Expression amount of CDR1 mRNA in C.parapsilosis isolates (A) and Expression amount of CDR1 mRNA in three groups of C.parapsilosis clinical isolates(B)

图3 近平滑念珠菌MDR1 mRNA的表达量(A)和MDR1基因在氟康唑耐药组、剂量依赖组和敏感组的表达量(B)Fig.3 Expression amount of MDR1 mRNA in C.parapsilosis isolates(A) and Expression amount of MDR1 mRNA in threegroups of C.parapsilosis clinical isolates(B)

图4 近平滑念珠菌MRR1 mRNA的表达量(A)和MRR1基因在氟康唑耐药组、剂量依赖组和敏感组的表达量(B)Fig.4 Expression amount of MRR1 mRNA in C.parapsilosis isolates(A) and Expression amount of MRR1 mRNA in three groups of C.parapsilosis clinical isolates(B)

3 讨 论

氟康唑是目前临床上使用最广泛的抗真菌药物。然而，氟康唑是一种抑菌剂，不能直接杀死真菌，这就为菌株耐药性产生和发展提供了有利条件。随着氟康唑大量、长期的应用于防治念珠菌感染，念珠菌的耐药程度越来越严重，耐药性越来越普遍，并且临床菌株常常会产生交叉耐药，使念珠菌感染防治更为棘手。本研究中牛源近平滑念珠菌对5种临床常用的抗真菌药物均存在一定的耐药性，并且耐药现象发生普遍。12株近平滑念珠菌试验株对5-氟胞嘧啶、两性霉素B的敏感率均高于75%，对唑类药物的耐药率均高于50%，其中氟康唑的耐药率最高，达58.3%。因此兽医临床耐药性检测十分必要，耐药性念珠菌有可能通过食物链传播给人类，对人类的健康造成威胁，尤其对患有慢性疾病和免疫力低下者的危害更大。药敏试验结果提示，牛源近平滑念珠菌对唑类耐药率高且具有多重耐药性，但兽医临床不使用抗真菌和免疫抑制剂等药物，其抗真菌药物耐药性如何获得、多重耐药性如何产生以及与大量使用广谱抗生素之间是否存在关联，是值得探究的一个问题。

念珠菌耐药不仅与药物作用的靶酶基因突变或过表达有关，而且与外排泵基因突变或高表达及生物膜形成等有关。念珠菌中麦角固醇的合成与ERG3、ERG11基因有关，其突变或高表达可引起耐药[11]。Magobo等[12]发现大部分耐氟康唑的人源近平滑念珠菌临床分离株中ERG11序列存在错义突变A395T(Y132F)，而且这些存在Y132F突变的分离株比由其他耐药机制引起的耐唑类菌株更容易引起克隆传播[13]。Corzo-Leon等[14]对12株耐氟康唑的人源近平滑念珠菌的ERG11基因测序发现，其均存在T591C同义突变，部分存在A395T错义突变。本研究通过对牛源近平滑念珠菌试验菌株ERG11基因测序发现两个突变位点，错义突变A395T存在于所有试验菌株中，同义突变T591C只在耐药株和剂量依赖株上被检测到，猜测宁夏银川地区牛源近平滑念珠菌中Y132F突变在ERG11基因中可能出现了克隆传播，而同义突变T591C可能在牛源近平滑念珠菌对氟康唑抗性的产生中起了一定作用，其具体机制有待进一步探究。对ERG11基因mRNA表达量的检测发现，氟康唑耐药组ERG11基因表达量较高，且表达水平显著高于剂量依赖组和敏感组[15]，说明宁夏银川地区牛源近平滑念珠菌中ERG11基因的高表达与其耐药性存在相关性，同样的结论在光滑念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌和克柔念珠菌上也得到印证，但也有研究发现近平滑念珠菌氟康唑耐药株中ERG11基因的表达是下调的[16]，说明近平滑念珠菌ERG11基因的高表达不是其耐药性的唯一因素。

药物外排泵包括ABC转运蛋白超家族和主要易化扩散载体超家族。这些外排泵存在于所有细胞生物体中，参与保护细胞免受有害物质的损伤，他们的过表达与微生物多药耐药表型相关。研究已证实，白色念珠菌、都柏林念珠菌CDR1和MDR1高表达与其氟康唑耐药性相关[17-18]；近平滑念珠菌CDR1和MDR1高表达与其氟康唑耐药性也相关[19-20]。本研究对CDR1、MDR1mRNA表达量的检测发现，氟康唑耐药组CDR1基因表达水平显著高于敏感组，MDR1基因表达水平显著高于剂量依赖组和敏感组，其结果与以上研究报道相一致。转录调节因子的突变或高表达可以上调药物外排泵和麦角固醇生物合成酶，从而使菌株表现出耐药性，此类研究已在白色念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌上得到了实验数据的支持[21-23]。本研究对MRR1mRNA 表达量的检测发现，氟康唑耐药组MRR1基因表达水平显著高于剂量依赖组和敏感组，实验结果与上述研究相符合。

综上所述，本研究中宁夏银川地区牛源近平滑念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药率较高且具有多重耐药性。ERG11基因中的T591C突变以及ERG11、CDR1、MDR1、MRR1基因的高表达都可能在牛源近平滑念珠菌氟康唑耐药性的产生中起到一定的作用。基于本研究的试验数据，后续将针对近平滑念珠菌细胞外磷脂酶活力与其氟康唑耐药性之间的关系，棘白菌素类不敏感株与其靶酶基因FKS突变及高表达相关性等方面进行研究，为进一步指导兽医临床预防奶牛真菌性乳房炎提供参考。