竹炭固定化施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri ZH-1降解苯酚的研究

张泽锟， 闫 勇， 黄 霞， 刘靖靖， 刘晓琦， 胡青平

(山西师范大学 生命科学学院，山西 太原 030000)

苯酚作为一种难以降解的有毒污染物，低浓度就能对水体中的生物和人类身体造成巨大的伤害。苯酚在工业生产中应用非常广泛，通常在化工生产的过程中作为原料出现，在皮革制造、香料生产等产业中使用。然而一个不容忽视的问题是其常在使用后产生大量的含酚废水，这些废水如果直接排入自然界，将会对环境造成严重破坏[1-3]。目前，为解决微生物法运行中存在的生物量易流失等问题，人们更多地采用微生物固定化技术[4-6]。微生物固定化是将分散、游离的微生物通过物理或化学手段将其集中在一个限定区域，通过提高单位空间内的微生物浓度，以提高其活性及重复利用其功能的生物技术。微生物固定化技术在水污染治理中应用非常广泛，该技术利用不同的载体材料固定各种各样的微生物，降解或吸附废水中的营养盐、酚类污染物[5-7]。载体材料的选择是这项技术的关键，良好的载体不仅可以提高微生物的数量和活性，维持微生物细胞的稳定性，而且在重复利用，对污染物保持较高去除效果方面往往表现出更为显著的优势[8-10]。夏丽[11]和吴芳芳等[12]分别使用海藻酸钙和聚乙烯醇固定化苯酚降解菌，结果显示，在高浓度苯酚条件下(>1 000 mg/L)，固定化菌的苯酚降解速率远高于游离菌。刘羽等[13]在用核桃壳固定化苯酚降解菌LQ-1的过程中发现，固定化后的菌株苯酚耐受能力由500 mg/L提高至700 mg/L，40 h内苯酚降解率可达97.83%。固定化后菌株的苯酚耐受性与降解性能均有提高，竹炭是以毛竹为原料，经过高温烧制、炭化干馏等步骤后制成，因其表面多孔，所以比表面积大，且具备吸附力，在使用过程中理化性能保持稳定，在研究与工业生产中廉价易得，经常用作微生物的固定化载体[8]。本研究以PseudomonasstutzeriZH-1为研究对象，前期在对其降解苯酚的研究中发现菌株ZH-1对苯酚的降解率可达89.6%，并且对菌株ZH-1的苯酚耐受性进行了测试，其苯酚最大耐受浓度为1 000 mg/L，并且在400 mg/L内，菌株ZH-1对苯酚的降解能力基本不受苯酚浓度影响。通过LC-MS结合KEGG通路得出菌株ZH-1降解苯酚是通过邻苯二酚1，2-加氧酶途径(C120途径)进行的，即苯酚在苯酚羟化酶(HO)作用下将苯酚转化成邻苯二酚，邻苯二酚在1，2-加氧酶(C12O)的作用下将邻苯二酚开环裂解产生己二酸，己二酸在顺，顺-粘糠酸内酯酶(LE)作用下分解成内酯，然后被分解为β-酮基己二酸，并进一步被彻底降解为琥珀酸和乙酰辅酶A而进入糖代谢途径。本研究采用竹炭作为固定化载体，对高效苯酚降解菌P.stutzeriZH-1采取吸附固定处理，研究其最佳固定化条件，并在此基础上，分析和对比固定化菌和游离菌在苯酚去除上的表现，考察竹炭固定化菌群是否对苯酚降解有促进作用，进一步研究竹炭固定菌多次重复利用去除苯酚的可行性，为竹炭固定化微生物在含苯酚污水治理方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 菌株PseudomonasstutzeriZH-1，于山西省临汾市汾河淤泥中分离，可以利用苯酚为碳源进行生长。保存于山西师范大学生命科学学院微生物实验室。

1.1.2 培养基 ①种子液培养基：直接用营养肉汤培养基配制。②固体培养基[11]：使用营养琼脂培养基配制。③苯酚无机盐模拟废水(MSM)[14](g/L)：(NH4)2SO4·12H2O 2，NaH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO40.2，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.001，苯酚含量按实验需求添加，pH值7～8。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 竹炭(粒径0.8 mm，比表面积600 m2/g，用蒸馏水清洗3次，灭菌后100 ℃烘干备用)购自上海海诺炭业有限公司；苯酚(纯度>99.9%)。台式离心机(Z36HK，德国贺默公司)；冷场发射扫描电子显微镜(SEM)(JSM-7500F，日本电子株式会社)；数显振荡培养箱(YHZ-98AB，上海一恒科技有限公司)；新世纪紫外可见光分光光度计(T6，上海菁华科技仪器有限公司)；光照培养箱(BSG-300，上海博迅科技有限公司)；酸度计(PSH-3C，上海雷磁仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1P.stutzeriZH-1菌悬液制备 无菌条件下将P.stutzeriZH-1接种到营养肉汤液体培养基，37 ℃、120 r/min培养至对数期，5 000 r/min离心10 min后，去上清，无菌水冲洗沉淀的细菌细胞，再次离心，重复3次，用无菌水调整菌悬液OD600至1左右，4 ℃储存备用。

1.2.2 菌株ZH-1的固定化 称量一定量竹炭加入锥形瓶中，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后按实验需求添加一定浓度的菌悬液，同时以相同浓度菌悬液添加于灭菌的空锥形瓶中作为游离态菌株，37 ℃、120 r/min振荡培养一定时间。取出锥形瓶，用无菌水清洗固定化细胞3次，即制备一份固定化菌悬液。

1.2.3 固定化条件的优化 ①单因素试验：三个单因素分别为接种量(竹炭量为1 g，按培养液的体积比，分别接种0.5%、1%、3%、5%、7%的菌悬液，振荡吸附36 h)、竹炭量(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g竹炭，接种量为3%(体积分数，下同)的菌悬液，振荡吸附36 h)和吸附时间(竹炭量为1 g，接种量为3%的菌悬液，分别振荡吸附12、24、36、48、60 h)，无菌水冲洗3次固定化细菌，参考丁鹏[15]对化工厂含酚废水中苯酚量的测定方法，加入含200 mg/L已灭菌模拟废水，120 r/min培养48 h后，计算降解率。 ②正交试验：以苯酚降解率为响应值，使用L9(34)正交试验确定固定化菌对苯酚的最适降解条件。

1.2.4 竹炭固定化菌的形态表征 使用SEM观察菌株ZH-1经竹炭固定化前后的特征变化。固定化前的竹炭无需处理，可直接在SEM下观察[16]。竹炭固定化后的菌株需先在2.5%的戊二醛溶液固定，然后经梯度酒精脱水、乙酸异戊酯置换、冷冻干燥后，SEM对竹炭表面及内部微生物的附着情况进行观察，观察竹炭作为固定化载体的特性。

1.2.5 固定化菌株与游离态菌株降解模拟苯酚废水试验 基于1.2.3中得出的竹炭固定化微生物的最适条件，在灭菌的锥形瓶中制备竹炭固定菌，然后向锥形瓶中加入含200 mg/L苯酚的已灭菌模拟废水(100 mL/250 mL)，进行竹炭固定菌对苯酚的降解试验[17]，以相同接种量的游离态菌株作为阴性对照，每6 h取样测定苯酚含量。同时，以竹炭对苯酚的吸附为空白对照，称取1.0 g灭菌的竹炭于含200 mg/L苯酚的无机盐培养基中，37 ℃，120 r/min振荡培养，直到吸附平衡，每6 h取样，测定苯酚含量，计算苯酚降解率。

1.2.6 竹炭固定化菌的重复利用性能试验 按照1.2.5的竹炭固定菌对200 mg/L模拟苯酚废水进行降解试验，降解结束后，离心取出固定化菌，先用无菌水清洗，然后用灭菌的无机盐培养基清洗，之后进行第二次模拟苯酚废水降解试验，按此方法连续重复10次，每轮均以游离态菌株作为对照。

1.2.7 苯酚含量测定及降解率计算 使用国标方法——4-氨基安替比林分光光度法对苯酚的含量进行测定[12]。降解率计算公式：苯酚降解率(%)=((苯酚初始量-苯酚剩余量)/苯酚初始量)×100%。

1.2.8 数据处理 使用SPSS 17.0进行邓肯氏单因素方差分析，Excel绘图。

2 结果与分析

2.1 竹炭固定化菌后的形态表征

竹炭在固定化菌前后的形态经扫描电镜表征见图1。由图1A可以看出苯酚降解菌P.stutzeriZH-1呈短杆状，菌落形态饱满，说明菌株对苯酚毒性有一定耐受性，具备固定化的条件。由图1B可见竹炭表面和内部的多孔结构为微生物在其中的生长附着提供了有利的条件，可以认为竹炭是一种比较合适的固定化载体。由图1C可见大量的细菌在竹炭的表面与空隙中生长，由于存在细菌与竹炭间的物理作用及细菌产生的胞外分泌物与竹炭间的黏合作用[18-20]，竹炭孔隙明显减少。苯酚降解菌P.stutzeriZH-1可以很好地附着在竹炭表面及其内部，但由于微生物和竹炭之间的吸附效应及竹炭内部空隙结构的不规则使得菌株吸附不均[21]。

图1 固定化前后竹炭的结构表征Fig.1 Structure characterization of bamboo charcoal before and after immobilizationA1～A3：P. stutzeri ZH-1；B1～B3：固定化前竹炭；C1～C3：固定化后竹炭A1-A3:P. stutzeri ZH-1；B1-B3:Before immobilization；C1-C3:After immobilization

2.2 固定化前后P. stutzeri ZH-1菌株降解苯酚能力的比较

竹炭固定化菌株P.stutzeriZH-1与游离态菌株对苯酚的降解作用及竹炭的吸附作用对比实验结果见图2。竹炭对苯酚具有一定吸附作用，且在24 h达到吸附平衡，对苯酚的吸附率为20%，说明在竹炭固定化菌降解实验整个过程中，竹炭对苯酚的吸附只占很小一部分，大部分苯酚的降解是通过微生物发挥作用的。同时，在同等接种量条件下，固定化菌相较于游离菌能够发挥更为明显的降解优势，48 h固定化菌株苯酚降解率达92.37%，与游离菌株仅80.12%相比，降解率增加了15%(P<0.05)。这可能是由于竹炭固定化体系中局部高菌密度，以及竹炭载体对微生物的保护作用使菌对苯酚的利用能力增大，对苯酚的降解产生明显的促进作用。以上结果表明，竹炭作为一种固定化载体，固定化苯酚降解菌之后，会对菌落产生保护和缓冲作用，削弱有害物质对细菌的冲击，同时菌落的高度密集也增加了对有害物质的抵挡，提高了对苯酚的降解[22-23]。因此，固定化细菌比游离态细菌具有更强的降酚能力，能够应用于实践。

图2 固定化菌株与游离菌株对苯酚的降解率Fig.2 Degradation rate of phenol by immobilized and free strains

2.3 竹炭固定化菌株条件的单因素优化

2.3.1 接种量对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响 不同接种量对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响如图3所示。随着接种量的增加，菌株ZH-1对苯酚的降解呈先增加后减少的趋势。当接种量为3%和5%时，苯酚降解率最大，分别为84.36%和86.01%，但两者无显著性差异(P>0.05)，考虑到经济节约的原则，选择3%的接种量作为后续正交试验的水平2。

图3 接种量对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on degradation of phenol by bamboo charcoal immobilized strain ZH-1不同小写字母之间表示显著性差异，P<0.05，下图同Different lowercase letters indicate significunt differences beween different treatments,P<0.05,same below

2.3.2 竹炭量对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响 不同竹炭量对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响如图4所示。当竹炭量小于1.0 g时，固定化菌株对苯酚的降解呈逐渐增大趋势。当竹炭量为1.0 g时，苯酚降解率最大，可达86.42%。当竹炭量大于1.0 g时，固定化菌株ZH-1对苯酚的降解呈逐渐减小趋势。说明过高或过低的竹炭量都会影响固定化菌对苯酚的降解，可能原因是当竹炭量较少时，可供菌液吸附的孔道和表面过少，菌液吸附不完全，固定的菌液量少，部分菌以游离的形式存在，固定化菌的优势不明显，降解率比较低。当竹炭量过多时，竹炭将游离菌吸附完全后还剩余一部分竹炭，剩余的竹炭会吸附培养液中的苯酚，导致苯酚减少，固定化菌可利用的碳源减少，固定化菌的生长量减少，使苯酚降解率降低[14]。因此，选择竹炭量1.0 g作为后续正交试验的水平2。

图4 竹炭量对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响Fig.4 Effect of bamboo carbon content on degradation of phenol by bamboo charcoal immobilized strain ZH-1

2.3.3 吸附时间对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响 不同吸附时间对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响如图5所示。在设置的竹炭吸附菌液时间梯度内，吸附时间为24 h和36 h时，苯酚降解率最大，分别为85.19%和83.54%，且二者之间没有显著性差异(P>0.05)，当竹炭吸附时间延长时，苯酚降解率呈现下降趋势。这可能是由于竹炭对菌的吸附固定化是一个缓慢进行的过程，吸附初始阶段，由于竹炭的孔道效应比较明显，同时菌体上存在大量丰富的对吸附过程有利的活性官能团，但随着吸附时间的延长，大量菌体聚集在竹炭的微孔和表面，使得竹炭的吸附位不断减少，吸附速率迅速降低，固定化菌苯酚降解率下降[24-25]。本研究选择36 h作为后续正交试验的水平2。

图5 吸附时间对竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影响Fig.5 Effect of adsorption time on degradation of phenol by bamboo charcoal immobilized strain ZH-1

2.4 竹炭固定化菌株条件的正交设计优化

以竹炭量(A)、接种量(B)和吸附时间(C)三个因素做单因素分析，设计L9(34)正交试验，结果见表1、表2。其中由方差分析的结果可知，竹炭量、接种量和吸附时间三个因素对竹炭固定化菌株降解苯酚没有显著性影响，但由直观分析表可知这三个因素都在一定程度上影响了微生物的固定化。根据正交实验直观分析表极差大小结果，以苯酚降解率为指标，影响竹炭固定化菌各因素主次顺序为竹炭量>吸附时间>接种量，且A2B3C1为最优组合，即竹炭量1.0 g，接种量5%，吸附时间24 h。

表1 L9(34)正交试验优化结果Table 1 Results of L9 (34) orthogonal test

表2 正交实验结果方差分析Table 2 Analysis of variance of orthogonal experiment results

2.5 最佳固定化条件验证

为验证正交实验结果，在实验分析所得最优组合条件下(竹炭量1.0 g，接种量5%，吸附时间24 h)，向锥形瓶中加入含苯酚200 mg/L的已灭菌MSM中进行竹炭固定菌对苯酚的降解试验，实验设置三个重复。测得平均降解率为92.88%，大于正交实验设计的最高值，说明最佳组合条件可行。

2.6 竹炭固定化菌的重复利用性能测定

为验证竹炭固定菌在降解苯酚中的重复利用性，对竹炭固定菌进行多批次的降解实验。图6表明，在添加竹炭固定体系后，苯酚的降解率相较游离菌体系有所增强。前5次降解实验结束后，竹炭固定菌体系中苯酚的降解率分别为90.36%、89.95%、88.75%、90.16%、89.55%，游离菌体系中苯酚的降解率分别为80.32%、73.49%、60.07%、59.43%、56.62%，通过对比可知，竹炭固定体系在经过5次重复利用后，降解率基本保持不变，而在游离菌体系中，伴随每次重复利用，苯酚的降解率呈大幅度下降趋势。在利用10轮后，竹炭固定菌的苯酚降解率下降为64.6%，游离菌的苯酚降解率下降至仅为23.6%，降解率增加了173%(P<0.05)。由此可见，伴随着重复利用次数的增加，固定化体系与游离菌体系中苯酚的降解率均呈现下降趋势，但竹炭固定菌体系的苯酚降解率下降趋势较为平缓，而游离菌体系中苯酚的降解率下降趋势则比较明显，两者之间的差距不断拉大，实验结果表明竹炭载体能够对菌株形成有效的固定，能够在生物处理系统的运行中提供长效、稳定的运行条件，为今后固定化体系在实际污染废水的处理中提供有价值的参考[26-28]。

图6 固定化菌株重复使用次数对苯酚降解的影响Fig.6 Effect of repeated use of immobilized strain on degradation rate of phenol

3 讨 论

本研究通过探究游离菌株P.stutzeriZH-1及其竹炭固定化菌株对模拟苯酚废水降解效果，研究了固定化技术在含苯酚废水治理中的应用，通过选择竹炭量、接种量和吸附时间三个因素，以固定化菌对苯酚的降解率为响应值利用正交试验确定最佳固定化条件：竹炭量1.0 g，接种量5%，吸附时间24 h，在该条件下竹炭固定化菌P.stutzeriZH-1对苯酚的降解效果有最佳表现，降解率为92.88%。利用SEM观察竹炭固定化前后的结构特征表明，竹炭的多孔结构在微生物的生长附着过程中提供了非常有利的条件，苯酚降解菌P.stutzeriZH-1可以很好地附着在竹炭表面及其内部。通过对比分析竹炭的吸附作用及竹炭固定化菌株与游离态菌株对苯酚的降解作用发现，竹炭对苯酚具有一定吸附作用，24 h达到吸附平衡，对苯酚的吸附率为20%。竹炭固定化菌株与相同接种量的游离菌相比，固定化菌株48 h苯酚降解率达92.37%，与游离菌相比降解率增加了15%(P<0.05)，显示出明显降解优势。胡婷[14]在研究中也有相同的发现，苯酚浓度为1 000 mg/L时，游离菌和竹炭固定化菌虽然均能完全降解，但是固定化菌的降解速率明显快于游离菌，说明竹炭固定化菌株可以有效提高对苯酚的降解能力。在经过10轮的重复使用后，固定化菌对苯酚的降解率仍然可达64.6%，与游离菌相比降解率增加了173%(P<0.05)，说明竹炭固定化菌在苯酚的降解过程中可以多次重复利用。丁鹏[15]在海藻酸钠固定化菌降解苯酚的研究中，固定化菌重复利用后对苯酚的降解率不变，但随着使用次数的增加，降解苯酚所需时间也逐渐延长，并且固定化材料每次使用会产生破损，只能重复使用5轮。竹炭作为固定化载体，可起到有效的固定作用，为生物处理系统的稳定运行提供有利保障，可为固定化体系处理污染废水提供参考。