高效液相色谱法同步测定甜叶菊提取物中7 种绿原酸

贾 铮， 徐思远， 杨建中， 池 磊， 李亚静，李 兰， 崔 婕， 肖志明， 李 阳， 樊 霞*

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，新疆乌鲁木齐 830063；3.诸城市浩天药业有限公司，山东诸城 262218）

随着2020 年全面禁止在饲料中添加抗生素，药食同源的植物提取物作为新型饲料添加剂将成为替抗领域关注的焦点 （曾建国，2020； 王平，2018）。甜叶菊中绿原酸类物质含量丰富，主要含有绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 等， 含量可达1.7%～7.2%（徐美利等，2021）。因具有促生长、抗氧化、改善肠道菌群等功效，绿原酸已被农业农村部批准为新饲料添加剂（王智勇等，2021）。 目前甜叶菊主要为生产甜菊糖苷的原料， 在生产过程中会产生大量废渣，若其中的活性成分没有得到高效、合理的利用，反而会对环境产生污染（孔智伟等，2017），因此针对甜叶菊中绿原酸等活性成分开发和利用的研究尤为重要。 张民达等（2020）建立了以绿原酸为内标，采用高效液相色谱法同时测定甜叶菊原料中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 6 种多酚类成分含量的方法，该法相对校正因子的耐用性良好，15 批甜叶菊原料一测多评法与外标法所得结果无显著差异。李华丽等（2017）建立了测定甜叶菊叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 6 种酚酸类成分的高效液相色谱法。 9 批样品中6 个酚酸之和为1.18%～6.67%，回收率、精密度、重复性、稳定性均符合有关规定。 Zhao 等（2019）对甜叶菊提取物中的酚类化合物进行了鉴定，研究显示，其含有丰富的绿原酸类、咖啡酸类、槲皮苷、槲皮素等8种活性成分，且具有良好的自由基清除能力和抗炎作用。Yu 等（2017）对甜叶菊茎提取物中香草酸、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸和隐绿原酸5 种酚类化合物进行了鉴定， 并研究了其对鱼油的抗氧化能力。本文旨在建立甜叶菊提取物中7 种绿原酸类成分的高效液相色谱分析方法，为甜叶菊提取物的质量控制和有效利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 UFLC-20A 液相色谱仪（日本Shimadzu 公司），配有2 个单独的超高压输液泵（LC-20ADXR）、自动进样器（SIL-20AXR）、柱温箱（CTO-20A）、 二极管阵列检测器 （SPD-M20A）；SK3300LHC 超声器 （上海科导超声仪器有限公司）；BP310/310g 型分析天平（德国赛多利斯公司）。

绿原酸及其类似物标准品：绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C（上海源叶生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Fisher 公司）；其余试剂均为分析纯；实验用水为经Mili-Q 纯化的超纯水（＞18.2 MΩ）。 实验样品由诸城市浩天药业有限公司提供。

1.2 标准溶液配制 准确称取7 种绿原酸及其类似物标准品各10.0 mg， 加入甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，配制成质量浓度为200 μg/mL 的标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存。分别移取一定体积上述标准储备液用水稀释，配制成标准系列溶液。

1.3 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（流动相A）-乙腈（流动相B）；流速：1.0 mL/min，梯度淋洗（梯度淋洗程序见表1）；柱温：30 ℃；检测器：二极管阵列检测器；进样量：10 μL；λ＝327 nm；外标法定量。

表1 梯度淋洗表

1.4 样品制备 称取0.05 g 甜叶菊提取物样品，置于100 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶液70 mL，超声提取30 min， 用50%甲醇溶液定容至刻度，样品溶液上机检测前过0.45 μm 滤膜。

2 结果与分析

2.1 方法条件优化

2.1.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器在200 ～400 nm 波长扫描得到新绿原酸、 绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 7 种化合物的光谱图，如图1 所示。结果表明，7 种化合物在波长327 nm 左右均有较大吸收峰，因此确定检测波长为327 nm。

图1 7 种绿原酸及其类似物光谱图

2.1.2 流动相的选择 通过检索文献， 绿原酸及其类似物的色谱分离主要采用甲酸、磷酸溶液，与有机流动相（甲醇、乙腈）按照一定比例进行梯度淋洗， 从而使得各化合物有效分离并检测。 本研究对甲酸溶液-乙腈、甲酸溶液-甲醇、磷酸溶液-乙腈、磷酸溶液-甲醇4 种流动相体系，通过优化对应的色谱条件并进行比较，最终选择稳定性、重复性较好的甲酸溶液-乙腈体系作为流动相，流速为1.0 mL/min， 并采用梯度淋洗进行各化合物分离， 分离后的7 种绿原酸及其类似物混合标准溶液色谱图见图2。

图2 7 种绿原酸及其类似物混合标准溶液色谱图

2.1.3 色谱柱温的选择 分别考察了25、30、35、40、50 ℃时7 种绿原酸及其类似物的分离情况，结果见图3。结果表明，随着色谱柱温度的升高，各化合物的保留时间逐渐减少，基线漂移逐渐明显，色谱柱温度达到35 ℃时， 洋蓟素峰型呈现显著变化，峰形展宽，峰高下降；而色谱柱温度为40 ℃时，绿原酸与隐绿原酸、异绿原酸B 与异绿原酸A分离度下降，无法达到基线分离。 综合考虑各组分有效分离的情况，色谱柱温度确定为30 ℃。

图3 7 种绿原酸及其类似物在不同柱温下的混合标准溶液色谱图

2.1.4 色谱柱的选择 从绿原酸及其类似物的结构及物理化学性质分析判断， 采用反相液相色谱法进行分离测定。 在色谱柱选择方面，比较了6 种不同品牌和型号的C18色谱柱对绿原酸混合标准溶液的色谱分离情况， 各色谱柱型号规格及系统适应性测试结果见表2。 通过各化合物的保留时间、出峰峰型、分离度等综合比较分析，选择ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）作为分析柱。

表2 不同品牌规格色谱柱色谱系统适应性测试结果

2.1.5 提取溶剂的选择 本研究中的7 种绿原酸及其类似物均溶于水、甲醇及丙酮，极微溶于乙酸乙酯，且甜叶菊提取物基质较简单，蛋白质、脂肪等干扰组分含量较小。 为此， 比较了不同溶液作为提取剂的提取效果，结果见表3。 结果表明，对于大部分化合物，水作为提取剂回收率较好，但对异绿原酸C 的提取效率较低；10%甲醇溶液、50%乙腈溶液、10%乙腈溶液提取均出现个别化合物提取效率低的情况。综合比较，50%甲醇溶液作为提取剂的提取效果最高，最终选用50%甲醇溶液作为提取溶剂。

表3 使用不同提取剂的测定结果（n=3）%

2.1.6 称样量的选择 分别准确称取0.02、0.05、0.10、0.50 g 和1.0 g 样品， 置于100 mL 容量瓶中， 加入50%甲醇溶液70 mL， 选择超声时间为30 min 进行提取并测定其含量，结果见表4。结果表明，不同称样量的实验结果存在显著差异，称取0.02、0.05 g 样品进行提取后的测定结果比较接近；当称样量大于0.10 g 时，提取效率显著下降，各绿原酸组分的测定值与称样量0.02、0.05 g 时相比，测定含量下降2 至15 倍，表明增加称样量时，提取不完全，提取效率下降。 为保证检测结果准确性和重复性，确定0.05 g 作为样品的称样量。

表4 不同称样量的检测结果比较（n=3）%

2.1.7 提取时间的选择 准确称取0.05 g 样品于100 mL 容量瓶中，加入70 mL 50%甲醇溶液，选择超声时间为10、20、30、40 min 进行提取，测定其含量。结果表明，超声提取20 min 的提取效果稍优于10 min， 与30 min 和40 min 的结果基本一致。 因此，确定30 min 作为方法的超声提取时间。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围 配制新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 7 种化合物系列混合标准溶液， 在优化的色谱条件下依次进样，重复3 次，以峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，7 种绿原酸及其类似物的线性范围、 线性方程、相关系数见表5。 7 种化合物在线性范围内呈良好线性关系。

表5 7 种绿原酸及其类似物的线性范围、线性方程及相关系数

2.2.2 方法检出限和定量限 在优化的实验条件下进行加标回收实验， 不断稀释提取溶液并上机测定，以3 倍信噪比（S/N）作为方法的检出限，以10 倍信噪比（S/N）作为方法的定量限，各目标化合物的检出限和定量限见表6。

表6 7 种绿原酸及其类似物的检出限和定量限mg/kg

2.2.3 方法回收率和精密度考察 精密称取样品0.05 g，置于100 mL 棕色量瓶中，添加不同含量的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸B、 异绿原酸A、 异绿原酸C 标准溶液制成含0.2%、0.4%、1.0%的样品，每个添加浓度进行6 次平行测定，并重复3 次，计算回收率、批内和批间相对标准偏差，结果见表7。 7 种绿原酸及其类似物的平均回收率为95.10% ～102.63%， 批内、批间相对标准偏差均小于5%。 结果表明，该方法对甜叶菊提取物中7 种绿原酸及其类似物的含量测定均有较好的准确度和精密度。

表7 7 种绿原酸及其类似物的加标回收率和精密度%

3 结论

本研究建立了甜叶菊提取物中绿原酸、 新绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸B、异绿原酸A、 异绿原酸C 7 种绿原酸及其类似物含量的分析方法。以超声提取法对样品进行前处理，以甲酸溶液-乙腈作为流动相， 采用梯度淋洗进行各化合物的分离， 各组分在12 min 内实现有效分离。本研究建立的方法准确度和重复性较好， 可满足甜叶菊提取物中绿原酸及其类似物定性和定量分析的需求， 为甜叶菊提取物有效成分的质量控制提供了一种可靠的分析方法。