白眉草总黄酮超声辅助提取工艺优化及抗菌活性研究

章烨雯， 臧青民， 蒋德旗， 韦 敏， 李桂芬

（玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000）

白眉草[Gerbera piloselloides（L.） Cass]，又名毛大丁草、一枝香、贴地风，为菊科菊木族植物（广东中药志委员会，1994；广西卫生局，1992），在我国广西、浙江、四川、广东、云南以及国外缅甸、非洲等地均有分布。白眉草化学成分复杂多样，含有香豆素类、黄酮类、甾醇类、苯骈吡喃、萜类、糖苷以及有机酸等多种活性成分（张贝西等，2019；肖瑛等，2002）。其中，黄酮类是白眉草中含量较高的一类成分，具有抗菌、抗炎镇痛、抗肿瘤、止咳化痰、抗水肿等多种药理活性（魏良柱等，2014）。 另外，该类化合物能促进动物健康育肥，其作为饲料添加剂有助于增强动物的免疫力， 同时提高肉类品质（冯香安，2011）。超声辅助技术是近年来用于黄酮类化合物提取的一种重要方法，具有耗时短、效率高、无污染等优点（赵二劳，2018）。 本研究采用超声辅助方法对白眉草总黄酮进行提取， 在单因素试验结果的基础上采用正交设计对其提取工艺进行优化，并考察其抗菌活性，为白眉草在饲料添加剂中的开发利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器材料 白眉草购于玉林市中药材市场，经过鉴 定为菊 科[Gerbera piloselloides（L.） Cass]菊木族（Compositae）植物白眉草（MutisieaeCass.）的干燥全草；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，为玉林师范学院生物与制药学院微生物实验室取供试细菌；琼脂粉（杭州微生物试剂有限公司）；牛肉浸膏（广东环凯微生物科技有限公司）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯霉素（江西忠鸣医药原料有限公司）；无水乙醇（分析纯，重庆湘鸿化工有限公司）；无水甲醇（分析纯，河南天骄化工有限公司）；氯化钠（洛阳市化学试剂厂）。

新型密封式粉碎机（广州雷迈机械设备有限公司）； 电子游标卡尺 （砀山县通和量具有限公司）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；HH-2 数显恒温水浴锅 （常州国华电器有限公司）；HH.B11.600-S-Ⅱ电热恒温培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 采用硝酸铝-亚硝酸钠显色法建立芦丁标准曲线 （黄明堦，2009）。精确称取芦丁标准品15.00 mg，制备0.6 mg/mL标准液。 在510 nm 波长测定溶液的吸光度， 以浓度X为横坐标， 吸光度Y为纵坐标得到线性回归方程Y=9.9449X+0.0169（R2=0.9999），表明芦丁在0.012 ～0.240 mg/mL 与吸光度呈良好的线性关系。

1.2.2 白眉草总黄酮提取及测定方法 精确称取20.0 g 白眉草粉末于锥形瓶中，按照一定的条件进行超声提取，超声结束后减压抽滤，滤渣再进行二次提取，合并滤液，浓缩，得白眉草总黄酮提取物。

取白眉草总黄酮提取物定容到100 mL，吸取1 mL 于10 mL 容量瓶中， 按照测芦丁标准曲线的方法测吸光度值， 并根据回归方程计算白眉草总黄酮溶液的浓度。 计算公式如下：

总黄酮得率/% =（C×V×N）/m×100；

式中：C为溶液的浓度，mg/mL；V为溶液的定容体积，mL；N为测定时溶液的稀释倍数；m为提取用的中药材粉末质量，g。

1.2.3 单因素试验对白眉草总黄酮得率的影响称取白眉草样品20.0 g， 在超声功率固定为240 W 的条件下， 分别考察乙醇浓度 （50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）、超声温度（40、50、60、70、80 ℃）和超声时间（15、30、45、60、75 min）对白眉草总黄酮得率的影响。

1.2.4 正交试验优化白眉草总黄酮提取工艺 在单因素试验的基础上， 以白眉草总黄酮得率为指标，进行L9（34）正交试验，各因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

1.3 体外抗菌测定

1.3.1 菌液的配制 分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种到已制备并灭菌的牛肉膏蛋白胨斜面培养基上进行活化，于37 ℃培养24 h。将活化后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃培养24 h，制成菌悬液（Heidi 等，2012）。

1.3.2 滤纸片扩散法测定提取物的抑菌圈 将大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的菌悬液各0.5 mL，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上。 以无菌蒸馏水浸泡的药敏纸片作为空白对照， 氯霉素（200 μg/mL）浸泡的滤纸片作为阳性对照。 将浸泡在最佳工艺下得到的白眉草总黄酮提取物中的药敏纸片取出，晾干，分别放入已接好供试菌的平板相对应的区域内，经37 ℃培养24 h 后，观察其抑菌效果。做3 个平行试验，使用电子游标卡尺测量每组平板的抑菌圈直径，取平均值。

1.3.3 最低抑菌浓度的测定 用试管二倍稀释法（李金焕等，2016；刘丽娟等，2013）测定白眉草总黄酮提取物的最低抑菌浓度（MIC）。 将白眉草总黄酮提取物 （100 g/L） 稀释成50、25、12.5、6.25、3.125 g/L 和1.5625 g/L 等浓度溶液。 分别将大肠杆菌菌悬液或金黄色葡萄球菌菌悬液0.5 mL 均匀涂布于培养皿中， 然后将浸泡各个浓度溶液的滤纸片放入培养皿中，测量抑菌圈大小。

1.3.4 最低杀菌浓度的测定 于上述最低抑菌浓度测定中的药液含量各吸取0.1 mL，分别放入相应的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上， 涂布均匀，并做好标记，经37 ℃培养24 h， 并观察有无细菌生长。结果判定：以培养皿中计数少于5 个菌落的药物浓度记为该药的最低杀菌浓度（MBC）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对白眉草总黄酮得率的影响 固定料液比1：20，超声温度60 ℃，超声时间45 min，研究不同乙醇浓度对白眉草总黄酮得率的影响，结果见图1。由结果可知，在一定范围内，随着乙醇浓度的升高白眉草总黄酮得率增大，当乙醇浓度为70%时，总黄酮得率达到最大值，随后总黄酮的得率下降。 这可能是乙醇浓度过高，将白眉草中的叶绿素等杂质溶出，从而影响总黄酮的提取。

图1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

2.1.2 料液比对白眉草总黄酮得率的影响 固定乙醇浓度70%，超声温度60 ℃，超声时间45 min，研究不同料液比对白眉草总黄酮得率的影响，结果见图2。 由结果可知，在一定范围内，随着料液比的增加，白眉草总黄酮得率逐渐增大，当料液比大于1:20 时，总黄酮得率达到最大值，随后总黄酮得率反而下降。这可能是随着溶剂的增加，将白眉草中的杂质溶出，影响黄酮化合物的溶解，使总黄酮得率降低。

图2 料液比对总黄酮得率的影响

2.1.3 超声温度对白眉草总黄酮得率的影响 固定乙醇浓度60%，料液比1:20，超声时间45 min，研究不同超声温度对白眉草总黄酮得率的影响，结果见图3。 由结果可知，在一定范围内，随着超声温度的升高，白眉草总黄酮得率增大，在超声温度为60 ℃时，总黄酮得率达到最高，随后总黄酮得率开始降低。这可能是温度过高，使黄酮部分结构被破坏，从而使总黄酮得率降低。

图3 超声温度对总黄酮得率的影响

2.1.4 超声时间对白眉草总黄酮得率的影响 固定乙醇浓度60%，料液比1:20，超声温度60 ℃，研究不同超声时间对白眉草总黄酮得率的影响，结果见图4。 由结果可知，在一定范围内，随着超声时间的增加白眉草总黄酮得率增大， 但当超声时间超过45 min 时，总黄酮得率反而下降。 这可能是时间过长，黄酮类化合物结构被破坏，导致总黄酮得率下降，确定超声时间为45 min。

图4 超声时间对总黄酮得率的影响

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验设计 在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、料液比、超声温度为因素，每个因素选取3 个较优水平，采用L9（34）正交设计进行试验，以总黄酮得率为指标，试验设计及直观分析结果见表2。 由极差分析可知，各因素主次顺序为：乙醇浓度＞超声温度＞料液比， 较优提取工艺为A2B2C2。

表2 正交试验设计及直观分析

2.2.2 方差分析 采用SPSS 20.0 软件进行方差分析，结果见表3。 由结果可知A、B、C 对总黄酮提取率影响显著（P＜0.05），影响白眉草总黄酮提取率的主次因素为A ＞C ＞B， 与直观分析结果相同。 因此， 白眉草总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比1:20，超声温度60 ℃。

表3 正交试验方差分析

2.2.3 提取工艺的验证 为验证工艺的准确性和合理性， 按上述最优工艺进行提取， 平行操作3批，分别测定吸光度值，计算总黄酮提取率。 结果显示最优工艺下， 白眉草总黄酮平均得率为3.96%，RSD 为1.64%，说明该提取工艺稳定、可行。

2.3 白眉草黄酮提取物体外抑菌试验结果

2.3.1 抑菌活性 由表4 可知， 白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径为8.70 mm， 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.52 mm， 均大于氯霉素的抑菌圈直径。试验结果表明，白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制活性。

表4 白眉草总黄酮提取物的抑菌活性

2.3.2 最低抑菌浓度的测定结果 由表5 可知，白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度为12.5 g/L， 对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为25 g/L。试验结果表明，白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，并且抑菌活性随着白眉草总黄酮提取物浓度的增加而增强。

表5 最低抑菌浓度的结果g/L

2.3.3 最低杀菌浓度的测定结果 由表6 可知，白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌的最低杀菌浓度为25 g/L， 对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为50 g/L。 试验结果表明，白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的杀菌作用，并且杀菌活性随着白眉草总黄酮提取物浓度的增加而增强。

表6 最低杀菌浓度的结果g/L

3 结论

本文采用超声波辅助法对白眉草总黄酮的提取工艺进行了优化，在单因素试验结果的基础上，通过正交设计优化得到最佳工艺： 在超声功率固定为240 W 的前提下，乙醇浓度为70%，料液比为1:20， 超声温度为60 ℃， 超声时间为45 min。经过3 批验证，在最佳工艺条件下，白眉草总黄酮的提取得率为3.96%，该提取工艺稳定、可行。 同时还考察了白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。结果表明，白眉草总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用， 对大肠杆菌的MIC 为12.5 g/L，MBC 为25 g/L； 对金黄色葡萄球菌的MIC 为25 g/L，MBC 为50 g/L。