蛹虫草废弃米基发酵工艺初探

李欣南 ， 叶 齐， 田晓玲， 马新宇， 赵晓云， 韩镌竹

（1.辽宁省检验检测认证中心辽宁省农产品及兽药饲料产品检验检测院，辽宁沈阳 110016；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳 110016；3.沈阳市第四十三中学，辽宁沈阳 110036）

随着蛹虫草培育技术的成熟与发展，其产量也随之不断增大，据调查，平均每个生产厂家蛹虫草的产量可达2000 kg/月，而栽培蛹虫草剩余的废弃米基多达6000 kg 以上 （肖千明，2017）。然而， 这些废弃米基都作为废弃的原料被扔掉，不仅造成环境的污染，也造成了能源的浪费。 蛹虫草废弃米基是在蛹虫草采摘后所剩的蛹虫草的基础培养基（文庭池等，2017；韦强等，2009），富含大量的氨基酸、多糖、虫草素等营养物质，可利用价值很高 （王建芳等，2005； 韦会平等，2004）， 因此对其开发利用有可观的经济效益和社会效益（汪晶晶等，2016）。

当前，人民生活水平日益提高，人类对肉类、蛋类等食物需求不断提高， 促使相关产业迅速发展， 同时造成饲养畜类禽类的饲料不同程度上的短缺（刘艳新等，2017；乔枫等，2013）。 因此，将生产蛹虫草剩余的废弃米基作为一种基础培养基用于发酵生产，开发新型饲料，不仅可以减少对环境的污染也可避免资源的浪费（阮萍等，2017）。 因此，本试验以蛹虫草废弃米基为发酵培养基，利用酵母菌作为发酵菌株，以蛋白质、虫草素等营养指标为参考，确定发酵工艺，为开发出以废弃米基为原料的新型饲料产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 酿酒酵母、 嗜酸乳杆菌均由辽宁省检验检测认证中心提供。

1.1.2 培养基 蛹虫草废弃米基由沈阳虫林密宝北虫草食品科技有限公司提供； 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）、乳酸细菌培养基（MRS）购自青岛高科园海博生物科技有限公司。

1.1.3 试剂及仪器设备 尿素、氯化钠等试剂购自国药集团； 虫草素标准品购自上海安谱科技公司； 甲醇 （色谱纯） 购自默克股份有限公司；ESJ182-4 电子天平 （沈阳龙腾电子有限公司）；FW 80 高速粉碎机 （天津市泰斯特仪器有限公司）；三洋高压灭菌锅（MLS-3750-3780）；电热鼓风干燥箱YLA-6000 （上海实验仪器有限公司）；恒温培养箱（Memmert 260 INplus）；近红外光谱仪（Foss NIRS DS 2500）；高效液相色谱仪Agilent 1100（美国安捷伦科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 发酵基础培养基的制备 10%半固体废弃米基（以下称为10%固体米基），废弃米基与水的混合比例为1:10（m/m），经121 ℃高压灭菌15 min，冷却备用， 其余比例半固体培养基均按照料水质量比配制，灭菌方法同上。

1.2.2 平板计数 采用平板涂布法， 将样品用0.85%的生理盐水按1:10 依次稀释至适宜浓度，选取3 个稀释浓度， 分别吸取菌悬液0.1 mL 于事先准备好的培养基上（酵母菌使用YPD，嗜酸乳杆菌使用MRS， 混合菌使用两种平板分别计数）， 用一次性无菌涂布棒将菌悬液在培养基表面涂布均匀，放置培养箱内（酵母菌28 ℃，嗜酸乳杆菌30 ℃，混合菌29 ℃），培养72 h 计数（龚军辉等，2018）。

1.2.3 卫生指标的测定 霉菌总数按国标GB/T 13092 饲料中霉菌总数测定方法； 大肠菌群按国标GB/T 18869 饲料中大肠菌群的测定方法。

1.2.4 营养指标 按国标GB/T 18868 饲料中水分、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸、蛋氨酸快速测定方法近红外光谱法； 沙门氏菌按照国标GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法 （汤旭等，2013）。

1.2.5 虫草素的测定 采用高效液相色谱法进行测定，以甲醇：水=85:15 等度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃。 取虫草素标准品， 分别配制1、5、10、20、50、100 μg/mL 浓度的标准品溶液，测定标准品的峰面积，并以标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

空白米基及样品的含量测定：称取6 份发酵样品以及1 份空白米基，每份0.5 g，分别置于100 mL锥形瓶中， 加入80 mL 水，85 ℃水浴加热3 h，30 min混匀一次，取出冷却后转移到100 mL 容量瓶中，定容至刻度线，摇匀；取1 mL 样品溶液离心后过0.22 μm 微孔滤膜，用于高效液相分析；每次进样10 μL，在260 nm 波长紫外灯下检测，每份样品重复测定3 次（李娟等，2012）。

1.2.6 正交试验 通过正交试验对二次发酵的主要影响因素发酵时间、米基添加量、接种量以及适当添加尿素等（汪伦记等，2012；焦静等，2012；杨丽英等，2008）进行筛选，找出显著性高的影响因素。 试验对米基添加量、接种量、发酵时间进行3因素3 水平L9（34）正交试验设计，以粗蛋白质含量为检测指标进行试验研究。 因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

根据正交试验设计法得到3 因素3 水平L9（34）正交试验设计表（表2）。 根据设计试验，每个试验号做3 组平行处理，共27 组试验。

表2 L9（34）正交试验设计

2 结果与分析

2.1 发酵菌种的确定 使用10%半固体米基分别接种1%（m/m） 酵母菌、 嗜酸乳杆菌或混合菌（酵母菌：嗜酸乳杆菌=1：1），培养24 h 后进行菌落计数。 对照组则采用生理盐水稀释至适宜浓度后进行菌落计数。 通过比较试验组和对照组菌体生长状况， 筛选出适用于此种培养基的最佳发酵菌种（江成英等，2018）。一次发酵试验的菌落计数结果见表3，从表中可以看出，三种发酵菌种方案中， 只有酵母菌在米基培养基中较对照组的菌落总数有所提高， 且废弃米基发酵前pH 为4.9，符合酵母菌发酵适宜pH 范围， 因此选择酵母菌作为最终的发酵菌种。

表3 发酵菌种菌落总数计数结果

2.2 一次发酵主要影响因素的确定 主要考察了添加量分别为7.5%、10%、12.5%（m/m） 的半固体米基，接种量为1%（m/m）发酵培养24 h 对菌落总数的影响。结果如表4 所示。三个米基添加量发酵得到的菌种菌落计数均有提高，10%米基添加量的培养基干湿度适中， 营养成分足够且有一定流动性，菌落计数最高，适用于酵母菌发酵，因此米基选用10%添加浓度。

表4 一次发酵米基添加量对菌落总数的影响

确定好米基最适添加量后， 考察发酵时间对菌落总数的影响。 从第10 小时开始，每隔2 h 观察菌落生长状况，保证菌种正常生长繁殖。选用在菌丝生长出前1 h 作为一次发酵的最适时间，经过试验得出最佳一次发酵时间为20 h。

2.3 二次发酵主要影响因素的确定 正交试验结果如表5 所示， 并由表7 和表8 的极差分析和方差分析可知，当因素为B（接种量）时极差最大，FB 值大于F 0.05（2，2），且水平在k2时出现最大值。 因此各影响因素中对粗蛋白质含量影响最显著的是因素B（接种量），最佳接种量为6%；其次影响显著的因素是时间； 米基添加量对粗蛋白质含量影响最小，以12.5%米基添加量为最佳。

表5 L9（34）正交试验结果与极差分析

表6 L9（34）正交试验方差分析

2.4 二次发酵单因素考察

2.4.1 米基添加量及发酵时间的确定 利用废弃米基和水配制成米基占总体积7.5%、10%、12.5%的废弃米基培养基，经121 ℃高压灭菌15 min 作为二次发酵的培养基， 一次发酵得到的菌液作为二次发酵的母液， 以6%接种量接入到二次发酵培养基中， 放入28 ～30 ℃恒温箱中分别发酵培养24、48、72 h 后，于烘箱中60 ℃烘干，冷却后粉碎，测定各项指标。 以粗蛋白质含量作为指标，结果如图1 所示。从图中可以看出，在米基添加量为12.5%，发酵时间为48 h 时，粗蛋白质含量最高。因此二次发酵的米基添加量和时间初步确定为12.5%米基添加量，发酵48 h。

图1 二次发酵米基添加量和时间对发酵的影响

2.4.2 接种量对发酵结果的影响 通过正交试验结果可知接种量对于发酵的影响最显著。 在一次发酵前期试验的基础上， 进行二次发酵接种量的确定，选取接种量为2%、4%、6%、8%、12%这5 个梯度进行试验， 并通过测定粗蛋白质含量确定最佳的接种量。试验结果如图2 所示。从图中可以看出，接种量为6%时粗蛋白质含量达到最大，随后便随接种量增大逐渐降低。因此，确定二次发酵接种量6%为最佳。

图2 接种量对发酵结果的影响

2.4.3 添加尿素对发酵结果的影响 作为畜禽饲料， 粗蛋白质含量是一项重要的指标（李劲松等，2018），而外加氮源不仅能影响菌种的生长发育，还能够有效提高粗蛋白质含量，因此发酵过程中尿素的添加量也是一项重要因素。本试验在前期试验基础上， 分别在二次发酵培养基中添加0.1%、0.5%、1%、2%、4%尿素（m/m），发酵48 h 后，粗蛋白质含量如图3 所示。粗蛋白质含量随着尿素添加量的增加而增大，但过大的尿素浓度会影响菌种的正常发育，因此综合考虑，尿素添加量为2%。

图3 尿素添加量对发酵结果的影响

2.5 发酵产物营养与卫生指标检测 根据试验最终得出废弃米基发酵工艺的最佳发酵条件，发酵3 批次，每批次3 组平行对照，每组发酵量约500 g，经60 ℃烘干，得到粗制品进行营养成分测定，结果见表7。经过酵母菌发酵后，粗蛋白质含量增加25.61%，Ca 含量增加2.51%，P 含量增加1.61%，粗脂肪含量增加23.42%，食盐含量增加23.4%。这说明废弃米基中的营养成分有不同程度的增加， 发酵过程对于提升废弃米基的营养价值有一定的作用， 可为进一步研究米基二次发酵条件提供参考。 试验对9 批次粗制品中霉菌总数、大肠菌群和沙门氏菌进行了检测，结果均为阴性。

表7 废弃米基发酵前后营养成分含量%

2.6 发酵产物中虫草素的含量测定 依据标准品分析的测定结果， 测得虫草素浓度与峰面积的标准曲线方程为：y＝36.819x-15.265（r2＝0.9996），在1 ～20 μg/mL 内线性关系良好，虫草素标准品HPLC 图见图4-B。 发酵产物以及空白米基HPLC图见图4-C、图4-A。 6 份样品虫草素含量测定结果见表8，与发酵前米基中虫草素含量相比，经发酵后蛹虫草废弃米基中保留了虫草素， 并且发酵过程对虫草素没有影响， 这对废弃米基作为一种新型发酵饲料具有极大价值。

图4 发酵产物中虫草素含量测定

表8 发酵产物虫草素的含量测定结果（n=3）

3 讨论

本试验通过对废弃米基的二次发酵， 优化确定了一套废弃米基发酵的最适条件：以酿酒酵母为发酵菌种，一次发酵米基添加量为10%（m/m），接入1% （m/m）酵母菌，30 ℃发酵20 h；二次发酵米基添加量为12.5%（m/m），接入6%（m/m）一次发酵酵母混合物，2%尿素添加量，30 ℃发酵48 h。发酵过程中应注意卫生问题，并随时排查杂菌污染。

发酵过程中最关键的就是发酵菌种的选择，优良的菌种能保证发酵饲料产品的质量， 且最大量地提高饲料中的菌体蛋白。 发酵菌种应该具有以下特性：（1）有较强的环境适应性，能在以原料为培养基的环境中正常生长；（2）繁殖速度快，产蛋白效率高；（3）自身及代谢产物无毒无致病性。 其次，在生产中接种量也很关键，接种量过小，发酵菌种发育缓慢，接种量过大，易导致发酵菌种生长过快，营养物质过快消耗，影响菌种正常发育。 因此确定最佳的接种量是发酵试验成功的重要一步。

有报道称，将发酵后的米基饲料添加到日粮中，可一定程度地提高蛋鸡日粮营养物质含量，满足蛋鸡每日所需的营养物质 （李劲松等，2018；吴良柱等，2009）。 本试验通过对废弃米基进行发酵，发现废弃米基中的粗蛋白质、无机物Ca、P 等营养物质的含量均有所提高， 且保留了蛹虫草废弃米基中特有的虫草素， 发酵产物颜色棕黄色，具有酒香味，气味和色泽均较发酵前有所改善。 蛹虫草废弃米基作为目前一种产量大，利用率低的生物资源，如果能够对其深入研究，对于开发天然、绿色、抗病的新型饲料，减少抗生素的滥用（邵建忠等，2017）及环境污染等，具有重要意义。