基于年龄分层BRAF-V600E基因突变对甲状腺乳头状癌的临床意义

艾中伟 李兴江 董海影 明玥 沈博

【摘要】目的：探讨甲状腺乳头状癌患者中BRAF-V600E基因突变的表达情况。方法：选择2015年1月-2020年12月期间齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心病理诊断为桥本氏甲状腺炎并发甲状腺乳头状癌（HT-PTC）、桥本氏甲状腺炎（HT）以及甲状腺乳头状癌（PTC）患者共135例为研究对象，均行BRAF V600E基因突变检测，对BRAF V600E基因突变与HT-PTC临床病理特征的关系进行分析。结果：与PTC组和HT组相比，HT-PTC组的BRAF-V600E突变率较高，组间对比差异明显（P<0.05），并且PTC组的BRAF-V600E突变率高于HT组（P<0.05）;HT-PTC组的PD-1/PD-L1、ERK、MEK以及KRT19阳性率均高于HT组和PTC组（P<0.05）;同时，BRAF V600基因突变与HT-PTC患者预后、肿瘤分期以及年龄有关（P<0.05），但是与发病部位、颈淋巴结转移以及肿瘤大小无关（P>0.05）。结论：BRAF V600E突变是女性桥本氏甲状腺炎发生甲状腺乳头状癌的一个重要诱因，并且与肿瘤分期和年龄有关，也是对HT-PTC患者预后进行判断的一个独立因素。

【关键词】甲状腺乳头状癌;BRAF-V600E基因突变;桥本氏甲状腺炎;病理特征

甲状腺乳头状癌（PTC）是比较常见的一种内分泌恶性肿瘤，其预后较好，术后10年生存率超过90%，但是一些PTC具有较强的侵袭性，容易出现转移和复发，不仅影响患者预后，也是导致患者死亡的一个重要原因。近年来，在关于甲状腺癌的分子机制研究中，发现鼠类肉瘤滤过性毒菌（v-Raf）致癌同源体B1（BRAF）基因突变是比较重要的一个因素，BRAF-V600基因突变在PTC患者中的发生率为28%-83%，但是在甲状腺良性病变组织和正常组织中均未出现。有文献报道，PTC患者同时往往伴有桥本氏甲状腺炎（HT），因此明确桥本氏甲状腺炎与甲状腺乳头状癌的关系，确定桥本氏甲状腺炎是乳头状癌的原因，还是结果，对于甲状腺乳头癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。因此，本文探讨了BRAF V600E基因突变与桥本氏甲状腺炎-甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系，现报告如下。

资料和方法

1.1一般资料

选择2015年1月-2020年12月期间齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心病理诊断为桥本氏甲状腺炎并发甲状腺乳头状癌（HT-PTC）、桥本氏甲状腺炎（HT）以及甲状腺乳头状癌（PTC）患者共135例为研究对象，年龄22-78岁，平均（49.5±8.4）岁，其中55例为HT，40例为PTC，40例为HT-PTC。纳入标准：（1）临床资料完善，且行BRAF-V600E基因检测;（2）肿瘤直径大小合适;（3）无其他癌症病史及放疗或化疗史，无吸烟史;（4）术后病理诊断明确;（5）无甲状腺、颈部淋巴结病史。排除标准：（1）病理诊断不明确，或者未行颈淋巴结清扫术;（2）未行BRAF-V600E基因检测;（3）肿瘤直径过大，不能明确其准确位置;（4）合并其他恶性肿瘤;（5）吸烟史、头颈部化疗以及放疗史;（6）甲状腺或颈部淋巴结病史。

1.2方法

1.2.1实时定量PCR检测

运用经典Trizol-氯仿法提取组织总RNA，琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外分光光度法测定RNA的浓度及纯度。取1μg总RNA，在20μL反应体系中用oligo（d）T引物和SuperScriptⅡ逆转录酶进行逆转录反应，获得cDNA产物。根据NCBI数据库提供的相应基因cDNA序列，用Primer Express Software v2.0设计特异SYBR Green Real-time PCR引物。以cDNA作为模板，在ABI 7000荧光定量PCR仪上的96孔板中用SYBR Green嵌合荧光法进行实时定量PCR反应。mRNA相对表达水平计算公式为2-△△CT，其中△△CT=（CT目的基因- CT看家基因）实验组-（CT目的基因- CT看家基因）对照组。

1.2.2检测KRT19蛋白表达

运用Western blot分析KRT19蛋白表达。采用蛋白提取试剂盒分别提取组织蛋白。将提取蛋白加200μL上样缓冲液，煮沸10 min，室温放置20 min溶解沉淀，置-80℃保存备用。用BCA法检测样品蛋白质浓度后，取50μg蛋白质经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2h分离。胶中蛋白质在70mA恒流状态下4℃过夜电泳转移至硝酸纤维素膜。膜在5%脱脂奶粉37℃封闭2h。将兔抗小鼠一抗与硝酸纤维素膜4℃培育过夜。与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 37℃温预1h。用Western印迹荧光发光检测试剂盒发光、压片，应用凝胶成像分析系统分析测定各组条带的积分光密度。同时，检测KRT19 mRNA，方法与上述基本一致。

1.2.3检测PD-1/PD-L1表达水平

借助免疫组化（SP三步法）染色法对肿瘤与黏膜组织内PD-L1表达水平进行测定。每次进行免疫组化时均用 PBS 代替一抗作阴性对照，以排除非特异性结合。37℃温水展片，1%多聚赖氨酸涂片，自然干燥，组织切片覆片，6℃烤片过夜，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min，无水乙醇及 95%、85%、75%乙醇各2min 浸泡后，自来水冲洗 2～3min，微波高火抗原修复，孵育 10min，封闭，加一抗和二抗，滴加 HRP 标记的链霉卵白素工作液，DAB 显色，苏木素复染，封片，拍照。

1.2.4检测MEK/ERK表达

采用实时定量PCR和Western blot检测MEK和ERK的表达，方法同上。同时采用免疫荧光法检测MEK/ERK蛋白表达及磷酸化水平。组织块放入液氮罐内速冻5min，将其取出后应用冰冻切片机进行冰冻切片，片厚20μm，切片经0.01M PBS清洗，与一抗4℃孵育过夜，0.01M PBS清洗，FITC標记荧光二抗1：1000，避光孵育1.5h，甘油封片。在荧光显微镜和图像处理系统上进行荧光显微成像。应用ImageJ软件计算荧光强度。

1.3观察指标

统计三组的KRT19、MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及BRAF-V600E阳性率，收集PTC的临床病理学特征，包括肿瘤预后、发病部位、肿瘤分期、颈淋巴结转移区域、颈淋巴结转移、肿瘤大小以及年龄，并且分析BRAF-V600E突变与PTC病理学特征之间的相关性。

1.4统计学分析

由SPSS20.0软件分析，其中计数资料由百分率（%）表示，组间比较行X2检验，运用t检验计量资料对比，以P<0.05表示有差异。

结果

2.1三组BRAF-V600E突变率比较

HT-PTC组、PTC组以及HT组的BRAF-V600E突变率分别为67.5%（27/40）、47.5%（19/40）、1.82%（1/55），组间比较有统计学意义（P<0.05）。

2.2三组MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及KRT19阳性率对比

与PTC组和HT组相比，HT-PTC组的MEK、PD-1/PD-L1、KRT19以及ERK阳性率均较高，组间对比有差异（P<0.05），见表1。

2.3HT-PTC临床病理学特征与BRAF V600基因突变之间的关系

BRAF V600基因突变与HT-PTC患者预后、肿瘤分期以及年龄有关（P<0.05），但是与发病部位、颈淋巴结转移以及肿瘤大小无关（P>0.05），见表2。

讨论

PTC是比较常见的一种内分泌系统恶性肿瘤，具有复杂的发病机制，与基因突变、免疫功能紊乱以及内分泌失调等诸多因素有关。有文献报道，HT合并PTC具有较高的发病率，约为55%-60%，提示癌变的发生和发展与HT密切相关。HT作为自身免疫性的一种甲状腺疾病，以体内出现特异性甲状腺抗体为主要表现，因为浆细胞和淋巴细胞浸润，可破坏甲状腺组织结构，从而降低甲状腺功能。而BRAF基因是比较重要的一个原癌基因，位于人类7号染色体上，编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是MAPK/ERK信号通路的一个关键分子，与黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌以及PTC等有关。研究发现，在甲状腺其他肿瘤中，BRAF-V600E发生突变较少，仅出现在PTC中，提示BRAF-V600E基因突变是诊断PTC的一个特异性标志物。也有文献报道，PTC的复发、转移以及侵袭性与BRAF-V600E位点的突变有关，不仅能够诱发正常的甲状腺滤泡细胞肿瘤，还可以促进和维持PTC的侵袭性。在本次研究中，HT-PTC的BRAF V600E突变率高于PTC组和HT组（P<0.05），其中HT组中仅有1例突变，与国内外研究报道基本一致，说明HT是否出现癌变与BRAF-V600E突变有关，并且BRAF-V600E也是导致HT癌变的一个重要危险因素。同时，BRAF V600基因突变与HT-PTC患者预后、肿瘤分期以及年龄有关，提示这一基因位点不仅有助于鉴别甲状腺良恶性肿瘤，还能判断患者预后。

综上所述，BRAF V600E突变是女性桥本氏甲状腺炎发生甲状腺乳头状癌的一个重要诱因，并且与肿瘤分期和年齡有关，也是对HT-PTC患者预后进行判断的一个独立因素。

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