Ac2-26对体外循环血清致大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护作用

曹雪丽，徐继洋，罗俊丽，郭宇含，张 红

(1.遵义医科大学 贵州省麻醉与器官保护重点实验室暨贵州省普通高等学校脑科学特色重点实验室，贵州 遵义 563099; 2.贵州省司法警察医院 麻醉科，贵州 贵阳 550004)

体外循环(Cardiopulmonary bypass，CPB)肺损伤是心脏手术常见的术后并发症之一，可发展为急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)，甚至急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，其死亡率高达40%[1]。肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cell，AECⅡ)是肺泡上皮细胞的重要组成部分，主要功能是合成和分泌肺泡表面活性剂，降低肺泡表面张力以防止肺泡萎陷，对肺的气体交换及屏障功能起着关键的作用。有研究发现[2]，在大鼠CPB肺损伤模型中，电镜观察到AECⅡ的嗜锇板层小体减少，线粒体水肿。因此，减轻AECⅡ损伤对寻找CPB肺保护措施有重要意义。

膜联蛋白A 1 (Annexin-A1，ANXA1)作为一种糖皮质激素调节的钙和磷脂结合蛋白，是重要的内源性抗炎因子[3]，Ac2-26是一种Annexin-A1 N端模拟小分子多肽，具有与ANXA1相似的生物学功能[4]。本实验拟用人体CPB血清建立大鼠原代AECⅡ损伤模型，加入Ac2-26共培养后，观察对大鼠AECⅡ的影响，为临床寻找有效的CPB肺保护措施提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康雄性野生型SD大鼠，8～12周龄，体重250～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(许可证号：SCXK(湘)2019-0004)。

1.2 药品、试剂和仪器 Ac2-26(美国，MedChemExpress公司)；Ⅰ型胶原酶(德国，Sigma-Aldrich公司)；胰蛋白酶、免疫球蛋白抗原、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、DAPI染色液(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM/F-12 培养基、胎牛血清(美国，Gibco公司)；Gallios流式细胞仪(美国，Beckman Coulter公司)；3111型细胞孵育培养箱(美国，Thermo公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；台式高速冷冻离心机、全波长多功能酶标仪(美国，ThermoFisher公司)；倒置荧光显微镜(日本，OLYMPUS公司)；X-500型高压蒸汽灭菌器(日本，TOMY公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠AECⅡ的原代培养 用戊巴比妥麻醉大鼠并注射肝素防止肺内血栓形成；麻醉起效后处死大鼠，浸泡于75%酒精溶液5 min；无菌条件下分离出肺及气管；消化酶消化肺组织13 min，终止消化，将肺组织剪成约1 mm3的组织块；120 r/min振荡5 min；细胞筛过滤，1 200 r/min离心5 min；裂解红细胞后，1 150 r/min离心5 min；弃上清，培养基重悬后置于IgG包被的培养皿中；孵育1 h后，吸取上清液以1 000 r/min离心5 min；弃培养基收集沉淀，加入完全培养基，置于含5.0%CO2的37.0℃细胞孵育箱中培养。

1.3.2 大鼠AECⅡ的鉴定 免疫荧光法鉴定：提取原代AECⅡ悬液接种于事先已放置细胞爬片的6孔板中，24 h换液；培养至36 h，待细胞长满爬片50%时，去除培养基，PBS摇床清洗3次，每次5 min；4%甲醛固定15 min，PBS 摇床清洗3次，每次5 min；5%BSA封闭1 h；每张爬片滴200 μL SP-C一抗(1∶250)置于湿盒内于4℃冰箱过夜；PBS清洗3次，每次5 min；每张爬片滴200 μL 稀释好的二抗(1∶500)室温孵育2 h(避光)；PBS清洗3次，每次5 min；DAPI细胞核染色，避光孵育10 min；PBS清洗3次，每次5 min；每张爬片滴25 μL抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)封片；最后置于荧光显微镜下观察并采集图像。

电镜鉴定：将培养72 h后的贴壁细胞，弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗1次；0.25%胰酶消化，等体积培养基终止消化；1 000 r/min，离心5 min；弃上清，加入电镜固定液，4℃固定过夜；PBS清洗3次，每次5 min；乙醇梯度脱水、树脂浸透包埋并聚合；切片染色观察。

1.3.3 成人体外循环术后血清制备 选取16名风湿性心脏病手术患者，年龄(49.63±3.85)岁，手术时长(4.20±0.38)h，在体外循环停机后无菌采血，室温下静置1 h，4℃过夜；4℃，3 000 g，离心10 min，提取上清即为血清；56℃下灭活补体活性，-80℃保存备用。采血符合医学伦理学标准，并经遵义医科大学附属医院生物医学研究伦理委员会审查批准(伦理审查编号：KLLY-2019-117)。

1.3.4 体外循环血清浓度的筛选 将CPB术后血清与DMEM/F12培养基按2.5%、5%、7.5%、10%、20%的比例配置，分别加入培养72 h的大鼠AECⅡ中进行共培养，取共培养12 h的细胞及细胞上清液，用CCK8法检测细胞的生长活力和流式细胞仪检测细胞凋亡率，以此来筛选出最佳细胞损伤模型的建模浓度。结果显示：随着CPB后血清浓度的增加，细胞生长活力逐渐降低、而凋亡率增加，7.5%、10%、20%的CPB后血清对大鼠AECⅡ均有损伤作用，但20%的CPB后血清组的细胞凋亡率高达53%，细胞生长活力已下降到37%，说明细胞受损严重继续培养难以存活。10%CPB后血清组细胞凋亡率明显比7.5%组高，细胞生长活力两组间比较差异不具有统计学意义，提示10%CPB后血清对大鼠AECⅡ有损伤作用，对细胞活力影响较小，故本实验选择10%CPB后血清作为建模浓度(见表1)。

表1 各组大鼠AECⅡ生长活力及凋亡率的比较

细胞完全培养基的制备：在超净工作台内，将胎牛血清与大鼠CPB后血清均按10%的比例加入DMEM/F12培养基中，制备成完全培养基，经滤菌器过滤后加入1%的青链霉素混合液。

1.3.5 Ac2-26浓度的筛选 A组为CPB血清与药物及细胞共培养组，根据不同的药物浓度分为A1组0.125 μmol/L、A2 组0.25 μmol/L、A3 组0.5 μmol/L、A4 组1.0 μmol/L、A5组2.0 μmol/L、A6组为4.0 μmol/L、A7组8.0 μmol/L，CCK-8法分别检测各组细胞生长活力变化及流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果显示：加入AC2-26后，0.25、0.5、1.0 μmol/L浓度组细胞凋亡减少，细胞活力增强，但0.5 μmol/L浓度组细胞凋亡率最低(17.8±0.68)%，提示0.5 μmol/L浓度的AC2-26减轻大鼠CPB血清诱导的AECⅡ损伤效果最佳(见表2)。

表2 各组大鼠AECⅡ生长活力及凋亡率的比较

1.3.6 实验分组 将培养72 h生长状态良好的AECⅡ分为3组：①正常培养组(N组)：10%的胎牛血清共培养12 h；②体外循环血清组(C组)：成人10%体外循环后血清共培养12 h；③Ac2-26组(A组)：在C组基础上，于培养基中加入0.5 μM Ac2-26，共培养12 h。

1.3.7 CCK8法检测细胞生长活力 将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100 μL，约含105个细胞，置于细胞培养箱中正常培养至72 h后，加入相应培养基共培养11 h；避光条件下，PBS清洗后更换新鲜培养基；每孔加入10%完全培养基90 μL和CCK-8试剂10 μL；置于细胞培养箱中培养1 h后，通过酶标仪测定在450 nm 处各组的OD值，根据说明书的公式：细胞相对活力(%)=(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。

1.3.8 流式细胞技术检测各组细胞凋亡率 细胞正常培养72 h后加入相应培养基，共培养12 h；加入不含EDTA的0.25%胰酶2 mL，3～5 min后，终止消化， 1 000 r/min离心5 min；弃上清，4℃预冷的PBS 2 mL重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，此步骤重复2次；弃上清，用1X Annexin V结合缓冲液1mL进行重悬；将5μL Annexin V-FITC加入100 μL单细胞悬液，室温下避光孵育15 min；加入5 μL PI试剂和200 μL 1× Annexin V 结合缓冲液，室温下避光环境孵育5 min，上机检测。

2 结果

2.1 大鼠AECⅡ的形态观察 倒置相差显微镜观察原代AECⅡ形态，在24 h，见细胞贴壁呈岛状或片状生长(见图1A)，48 h细胞贴壁较多，生长状态良好，细胞成簇生长，体积较前增大，呈梭型、多边型或立方型(见图1B)，72 h见细胞体积较前明显增大，饱满圆润，呈立方型生长(见图1C)，为最佳生长时期。

×200，标尺=500 μm。图1 正常AECⅡ培养形态对比

2.2 大鼠原代AECⅡ的鉴定SP-C免疫荧光染色结果 蓝色荧光为细胞核DAPI染色，红色荧光为SP-C蛋白表达，与细胞核染色图片组合后可见绝大多数细胞均可正常表达AECⅡ特异性蛋白SP-C，经使用Image J软件分析后，所提取细胞纯度达95%左右；透射电镜观察到AECⅡ的标志性细胞器——嗜锇板层小体，进一步确认细胞提取培养成功。

2.3 倒置相差显微镜观察各组大鼠AECⅡ形态变化 可见N组细胞形态正常，细胞核大小正常，细胞内颗粒物质分布均匀，其余二组均可见不同程度的细胞核肿大，细胞内颗粒物质分布不均，胞体变形，其中C组胞体形态较A组变化大。

A:N组；B: C组；C:A组；×200，标尺=500 μm。图2 各组AECⅡ光镜的变化

2.4 各组大鼠AECⅡ中SP-C表达的变化 各组细胞均可有SP-C表达，N组胞质内见高强度荧光表达，均匀分布于胞质内，胞核居中；A组细胞形态与N组接近，胞质内蛋白表达均匀，荧光表达强度高；C组与N组及A组相比，细胞胞质松散，细胞核出现聚集征象，部分细胞出现破裂坏死，荧光表达强度明显减弱；通过免疫荧光平均强度分析，N组与A组SP-C荧光表达强度的差异无统计学意义(P=0.647)；C组荧光强度低于A组(P=0.043)及N组(P=0.016，见表3，图3、4)。

×200，标尺=20μm。图3 各组AECⅡ中SP-C表达的变化

2.5 各组大鼠AECⅡ透射电镜下变化 N组细胞形态正常，胞质内可见结构完好的嗜锇板层小体，线粒体无水肿；A组细胞见嗜锇板层小体结构相对完好，可见部分线粒体轻度肿胀；C组细胞胞核疏松，特异性结构嗜锇板层小体的平行排列消失，线粒体肿胀明显(见图5)。

图4 各组AECⅡ中SP-C荧光平均强度的变化

A:N组；B: C组；C:A组。红色箭头处为AECⅡ标志性细胞器嗜锇板层小体；×20 000，标尺=2 μm。图5 各组AECⅡ电镜下的变化

2.6 各组大鼠AECⅡ生长活力的比较 N组细胞活力明显高于C组(P=0.009)，N组与A组细胞生长活力差异无统计学意义(P=0.743)；C组与N、A组相比，细胞生长活力下降超过30%(见表3，图6)。

*：与N组比，P<0.05；#：与C组比，P<0.05。图6 各组AECⅡ生长活力的比较

表3 各组AECⅡ生长活力、凋亡率及SP-C平均荧光强度的比较

2.7 各组大鼠AECⅡ的细胞凋亡率比较 N组与A组细胞凋亡率均在10%之内，而C组凋亡率在23%以上，N组(5.58±0.58)与C组(P<0.001)及A组(P<0.001)之间的差异均有统计学意义，其中N组的凋亡率最低，C组(29.50±0.47%)与A组(7.28±0.40%)的差异有统计学意义(P<0.001)，A组凋亡率明显降低(见表3，图7)。

A：N组；B：C组；C：A组；D：各组细胞凋亡率组间比较；*：与N组比，P<0.05；#：与C组比，P<0.05。图7 各组AECⅡ凋亡率的变化

3 讨论

CPB是一种非生理循环系统，CPB诱导的肺损伤机制尚未完全阐明，目前认为主要的因素有全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和肺缺血-再灌注损伤 (Lung ischemia-reperfusion injury， LIRI)[5]，具体机制不清。研究发现，在大鼠LIRI中，AECⅡ是重要的损伤效应细胞[6]。本实验拟用人体CPB血清建立大鼠原代AECⅡ损伤模型，模拟CPB后AECⅡ受损情况。本实验用SD大鼠提取原代AECⅡ，培养48 h后，电镜下观察到嗜锇板层小体，经SP-C荧光染色发现有AECⅡ特有的SP-C蛋白的表达，细胞纯度可达95%左右。在正常培养的AECⅡ中加入成人10%的CPB术后血清，细胞凋亡率明显增高，细胞相对活力也明显下降；免疫荧光下见细胞胞质松散，细胞核出现聚集征象，部分细胞出现破裂坏死，SP-C荧光表达强度明显减弱；电镜下AECⅡ胞核疏松，嗜锇板层小体平行排列结构消失，空泡形成，线粒体水肿明显；光镜下见胞体及细胞核肿胀明显，胞质内可见颗粒物质大小不一，分布不均。说明CPB血清可以造成大鼠AECⅡ的损伤，大鼠原代AECⅡ损伤模型成功建立。

本课题组前期研究发现，膜联蛋白A1拟肽Ac2-26可增加大鼠肺组织内源性ANXA1的表达及IL-10含量，促进肺中性粒细胞凋亡，明显减轻肺组织病理损伤，对肺有一定的保护作用[7]。同时也发现，外源性AnxA1拟肽Ac2- 26通过与FPR结合可减轻大鼠体外循环肺损伤，降低肺组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1和NF- κb p65水平，使肺组织的病理损伤评分减低[8]。Luo等[9]研究发现，运用Ac2-26可以抑制LPS诱导的星形胶质细胞迁移，通过p38、JNK-MAPK信号通路，减少促炎性介质TNF-α、IL-1β、MCP-1和MIP-1α的产生，从而缓解炎症性疼痛。在LPS诱导的A549细胞损伤模型中，Ac2-26可抑制细胞凋亡，使促凋亡蛋白Bax和caspase-3水平降低，而Bcl-2上调，并且提高细胞活力[10]。说明Ac2-26在体内发挥着抗炎作用，能减轻组织与细胞的损伤。本实验研究发现在CPB血清组细胞中加入Ac2-26后，A组细胞胞质内SP-C蛋白表达均匀，荧光表达强度(0.992±0.016)高于CPB血清组(0.940±0.016)；电镜下见嗜锇板层小体结构相对完好，可见部分线粒体轻度肿胀；细胞凋亡率(7.28±0.40)%明显低于C组(29.50±0.47)%，细胞生长活力(0.96±0.21)明显高于C组(0.68±0.11)，说明Ac2-26可提高细胞SP-C蛋白表达，减轻CPB血清诱导的离体大鼠AECⅡ损伤，对细胞有一定的保护作用。其结果将为寻找CPB肺保护措施提供理论依据。