吴茱萸次碱纳米混悬凝胶贴膏经大鼠神阙穴给药的药代动力学分析
2022-03-17周开花欧水平丁刚红龚余惠
周开花,欧水平,丁刚红,龚余惠,王 森
(1.遵义医科大学 药学院药剂学教研室,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学附属医院 药剂科,贵州 遵义 563099)
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth的干燥近成熟果实,其性热,味辛苦[1],具有散寒止痛、降逆止呕,助阳止泻的功效[2]。吴茱萸穴位贴敷至今仍广泛应用,常贴敷穴位涌泉穴和神阙穴用于治疗内、外、妇、儿科等多种疾病[3-5],并拓展用于治疗失眠[6]、高血压[7]等,具有简、效、便、廉的特点。吴茱萸次碱(Rutaecarpine,RUT)是吴茱萸的药效成分,具有抗炎、镇痛、抗血栓形成、抗血小板聚集、保护心脏和体温调节等药理作用[8-10]。研究表明,RUT脂水均难溶,限制其口服吸收,在体皮肤微透析实验发现,RUT具有缓慢透皮、渗透量高的特点[11]。研究认为,神阙穴位皮肤给药的透过量及速率显著高于非穴位皮肤[12],但尚未见RUT外用制剂神阙穴贴敷的体内透皮吸收动力学研究。前期将RUT制成纳米混悬凝胶,可促进RUT的经皮吸收[13]。凝胶贴膏具有载药量高、维持稳态血药浓度、延长给药间隙、使用方便及降低不良反应等优点[14]。本文将RUT制成吴茱萸次碱纳米混悬凝胶贴膏(Rut-nanosuspension based gel patch,RUT-NGP),以SD大鼠为动物模型,建立体内RUT的分析方法,并对该方法进行方法学验证,研究RUT-NGP经神阙穴贴敷给药后大鼠体内的药代动力学特征,测定了RUT药动学参数,为RUT-NGP穴位贴敷疗法的临床用药提供药动学基础和理论依据,为RUT新剂型的研究开发提供实验依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 WiSys 5000 高效液相色谱系统(月旭科技(上海)股份有限公司);TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂);DURA12超纯水机(泽拉布仪器科技(上海)有限公司);Xw-80A漩涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);YGC-12氮吹仪(成都雅源科技有限公司);QPA-08LP空气发生器(上海全浦科学仪器有限公司);QPN-5L氮气发生器(上海全浦科学仪器有限公司);ME204E电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);Sartorius BT125D分析天平(Sartorius科学仪器(北京)有限公司);N5型多功能修毛磨甲器(宁波爱克利浦电器有限公司);DL-820D智能超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);AH-2010高压均质机(ATS Engineering inc),TB-0612B型实验用涂布机(上海铠凯科技贸易有限公司)。
1.2 试药 吴茱萸次碱原料药(陕西昊辰生物科技有限公司,WZYCJ180325,纯度91%),吴茱萸次碱对照品(成都曼思特生物科技有限公司,MUST-16040314,纯度99.97%),色胺酮(成都埃法生物科技有限公司,AF8120201,纯度98%),乙醚(重庆川东化工集团有限公司),肝素钠(北京索莱宝生物科技有限公司),医用胶布胶带(青岛海氏海诺集团有限公司),RUT-NGP(遵义医科大学药学院药剂学实验室自制,批号20210625,RUT粒径(193.27±2.87)nm,RUT含量3.99 mg/cm2),纯水(实验室自制),甲醇、乙腈为色谱纯(月旭科技(上海)股份有限公司),其他试剂均为分析纯。
1.3 实验动物 健康雄性SD大鼠,体重180~220 g,购于遵义医科大学实验动物中心,合格证号SCXK(黔)2021-0002。
2 方法与结果
2.1 RUT含量测定方法的建立
2.1.1 对照品溶液和内标溶液的制备 精密称取RUT对照品适量,置于50 mL量瓶中,加甲醇适量,超声处理10 min,冷却后加甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,即得浓度为194.2 μg/mL的RUT对照品储备液,临用时配制成一系列浓度的对照品溶液。精密称取色胺酮(Tryptanthrin,TRY)适量,置于50 mL量瓶中,加入甲醇适量,超声使溶解,冷却后加甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,得205.6 μg/mL的内标储备液,临用时用甲醇稀释至100 μg/mL作为内标溶液。
2.1.2 色谱条件 色谱柱:Ultimate® LP-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相水-乙腈(30∶70);流速1.0 mL/min;检测波长343 nm;柱温30 ℃;进样体积20 μL。
2.1.3 血浆样品的处理和测定 大鼠眼眶取血置于经过肝素钠预处理过的1.5 mL EP管中,4 ℃冰箱放置2 h,取出后4 000 r/min离心15 min,取上层血浆,于-20℃冰箱中保存,备用。取大鼠血浆样品100 μL,加入10 μL内标溶液,涡旋混合1 min后,再加入乙腈800 μL(1∶8),涡旋混合2 min,在12 000 r/min的转速下离心10 min,取上清液,室温下氮气吹干,残渣加乙腈100 μL,涡旋混合2 min,12 000 r/min离心10 min,取上清液20 μL HPLC进样分析。
2.1.4 专属性考察 按2.1.2项下的色谱条件对空白血浆、空白血浆+内标溶液、空白血浆+内标溶液+对照品溶液、大鼠给药后血浆样品进行分析,见图1。结果表明,空白血浆中的内源性杂质能与RUT、TRY色谱峰分开,且RUT与TRY分离完全,不干扰测定,说明建立的方法专属性良好。
A:空白血浆;B:空白血浆+内标;C:空白血浆+内标+对照品;D:大鼠给药后血浆样品(1.色胺酮;2.吴茱萸次碱)。图1 RUT-NGP神阙穴贴敷给药后血浆样品的HPLC图谱
2.1.5 线性关系考察 取大鼠空白血浆样品100 μL,分别加入不同系列浓度的RUT工作液10 μL和10 μL内标溶液,配成含RUT一系列浓度的溶液,按2.1.3项下血浆样品的处理方法,2.1.2项下色谱条件进样分析,记录峰面积。最后以药物(RUT)浓度为横坐标(X),RUT与TRY的峰面积之比为纵坐标(Y),绘制标准曲线。求得RUT的标准曲线为Y=1.477 1X+0.002 1(r=0.997 3),线性范围为0.010 4~1.942 0 μg/mL,最低定量限为0.010 4 μg/mL。
2.1.6 精密度和准确度考察 精密吸取大鼠空白血浆100 μL,按2.1.3项下血浆样品的处理方法,制备低、中、高质量浓度的样品,每个浓度制备6份平行样品,连续测定3 d,按2.1.2项下色谱条件进样分析,记录色谱峰面积,代入标准曲线得到样品浓度,计算准确度和精密度(见表1)。结果表明,RUT的批内、批间准确度介于92.49%~103.18%之间,精密度RSD均<15%,说明该法精密度良好,符合生物样品测定标准。
2.1.7 稳定性考察 精密吸取大鼠空白血浆100 μL,按2.1.3项下血浆样品的方法处理,制备低、中、高质量浓度的样品,每个浓度制备6份平行样品,考察样品分别在室温条件下存放24 h、-20℃循环冻融3次及-20℃冰箱存放7 d条件下的稳定性,见表1。结果表明,稳定性RSD均<15%,符合生物样品测定标准。
2.1.8 提取回收率考察 精密吸取大鼠空白血浆100 μL,分别加入10 μL内标溶液和RUT对照品溶液,按2.1.3项下血浆样品的方法处理,制备低、中、高质量浓度的样品,每个浓度制备6份平行样品,按2.1.2项下色谱条件进样分析,记录内标和样品峰面积,计算样品浓度(A)。取大鼠空白血浆100 μL,加入甲醇20 μL,涡旋1 min后,加入800 μL乙腈,涡旋混匀2 min,以12 000 r/min的转速离心10 min,吸取上清液并在室温下氮气吹干,加入乙腈80 μL于残渣,再分别加入10 μL内标溶液和对照品溶液,配成含有RUT低、中、高质量浓度的血浆样品,每个浓度制备6份平行样品,涡旋2 min,12 000 r/min离心10 min,取上清液进样分析,记录色谱峰面积并计算样品浓度(B),提取回收率=A/B,见表1。结果表明RUT的提取回收率均>80%,RSD均<15%,符合生物样品测定标准。
表1 RUT在血浆中的准确度、精密度、稳定性和提取回收率试验
2.2 药代动力学试验 雄性SD大鼠6只,给药前12 h禁食,自由饮水,用电动剃毛刀除去大鼠腹部神阙穴及周围的长毛,再用小剪刀剪净剃毛区短毛。给药前用温水将大鼠腹部擦洗净并用棉花将水分吸干,给药时将贴膏1贴(给药面积2 cm2)紧密贴敷于大鼠腹部神阙穴(大鼠腹部正中线上,在剑突和耻骨上联合作一条连线,分为3等份,以上2/3和下1/3的交点作为神阙穴[15]),为防止大鼠中途因躯体扭动剐蹭将药膏脱落,在大鼠神阙穴给药处用一层纱布遮盖,边缘再用医用胶带加固,同时记录给药时间,于给药后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、36、48、60、72 h从大鼠眼眶取血0.5 mL,置于1.5 mL预先用肝素钠溶液润湿的EP管中,于4 000 r/min离心10 min,分离得到血浆,按2.1.3项下的方法处理血浆,HPLC进样分析,记录色谱峰面积,代入标准曲线计算大鼠体内血药浓度,将各个时间点为横坐标(X),血药浓度为纵坐标(Y),绘制血药浓度-时间曲线图(见图2)。RUT血药浓度数据采用PKSolver 2.0软件的非房室模型进行处理,拟合大鼠体内药动学参数(见表2)。
图2 RUT-NGP经大鼠神阙穴给药后RUT的药时曲线
表2 RUT-NGP经大鼠神阙穴给药后RUT的药动学参数
3 讨论
因加赋形剂调RUT粉末直接敷神阙穴给药不方便,故将其制备成RUT-NGP,不仅方便携带和贮存,且相对耳穴、针灸、推拿等疗法,穴位贴敷透皮吸收,作用直接、起效快、操作简便,是较为理想的给药途径[16]。
本实验建立了血浆中RUT的测定方法,结果表明,该测定方法的专属性良好,血浆中的内源物质不干扰RUT的测定,样品用量小,预处理简便,适合大批量样品分析测定。预实验发现,在72 h后取样的大鼠血样中,RUT的浓度已接近所建立的HPLC方法线性范围的最小值,故正式实验时在72 h内取样。
RUT-NGP经大鼠神阙穴贴敷给药后,RUT可透皮吸收入血,随着给药时间的增加,RUT血药浓度逐渐增加,直到约36 h后,RUT血药浓度缓慢减少,说明RUT-NGP具有缓释长效的给药效果。与文献[17]报道的吴茱萸巴布膏贴敷大鼠给药后的药动学行为比较,其Tmax为5.85 h,本研究的Tmax较其提高了6.6倍;与文献[18]吴茱萸提取物的经皮吸收药动学研究比较,本研究的半衰期t1/2和Tmax分别较其提高了16.45倍和11.87倍。与文献[19]大鼠口服不同浓度的吴茱萸提取物药动学行为比较,本研究大鼠体内血药浓度平稳,半衰期t1/2和Tmax明显增加,可能与RUT纳米化可改善其透皮吸收,提高RUT的生物利用度[13]有关,还可能是与RUT-NGP是经大鼠神阙穴贴敷给药,已有研究表明神阙穴经皮吸收比非穴位经皮吸收效果好[20]有关。
本文将RUT做成RUT-NGP经大鼠神阙穴贴敷给药后,有利于延长药物的作用时间,减少给药次数,能够满足某些疾病的治疗需求,进一步为RUT新剂型研发及临床研究提供参考和依据。但RUT-NGP经神阙穴贴敷给药的体内透皮吸收动力学的粒径及给药部位等影响规律尚不明确,有待进一步开展RUT-NGP和RUT凝胶贴膏、神阙穴和非穴位贴敷给药的药动学行为比较研究进行探讨和确认。