NOD1基因在Hp感染小鼠炎性反应及免疫功能的作用*

王 剑，贾纯亮，梁 磊，张 磊，李翰嵩，刘远廷

(河北省唐山市人民医院胃肠外科 063000)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰阴性螺旋形细菌，普遍存在于人的胃黏膜中，可定植于人胃黏膜上皮细胞，据报道全球已有超过一半的人感染Hp，是功能性消化不良、慢性萎缩性胃炎、肠黏膜肠化生、胃黏膜异常增生和胃癌的主要病因[1-3]。胃癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一，Hp参与胃癌的发生、发展过程，被WHO列为Ⅰ类致癌物[4]。虽然众多研究表明，Hp的根除有助于溃疡愈合，可降低胃癌发生风险，延缓淋巴瘤的进程，但到目前为止，Hp感染的预防及治疗效果仍不理想。因此，Hp感染对机体炎性反应及免疫功能的作用机制研究具有重要意义。核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(nucleotide binding oligomerization domain like receptor，NLR)是一类重要的细胞质内模式受体，可以识别、结合病原相关分子模式并激活一系列信号通路，诱导机体发生固有免疫应答[5]。核苷酸结合寡聚化结构域1(nucleotide binding oligomerization domain 1,NOD1)是NLR家族中一个重要的病原模式识别受体，可通过激活转录因子如核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，在炎症相关肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[6]。本研究拟通过建立正常小鼠经胃感染Hp模型，探讨Hp感染对小鼠炎性反应及免疫功能的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种和实验动物

Hp菌种购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号：700392。80只无特殊病原体(SPF)级C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌雄各半，体重18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。SPF级环境饲养，温度20～25 ℃，相对湿度45%～55%，光照周期12 h，自由饮食、饮水，适应性饲养1周。

1.1.2主要仪器与试剂

反转录PCR试剂盒购自美国Fermantas公司；小鼠干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)、小鼠干扰素β(interferon β，IFN-β)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自深圳欣博生物科技有限公司；兔抗鼠p65多克隆抗体、核纤层蛋白B1(lamin B1)抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam公司；FITC标记的兔抗鼠CD4、PE标记的兔抗鼠CD8a购自美国BD公司；光学显微镜购自日本Nikon公司；核酸蛋白分析仪购自美国Beckman公司；PCR仪购自珠海黑马医学仪器有限公司；凝胶图像分析仪购自美国Kodak公司；全自动酶标仪购自芬兰Lad systems公司；水平电泳仪、转膜仪购自美国Bio-rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1Hp的培养

从液氮中取出Hp菌种，立即放入40 ℃温水中迅速搅拌使其融化，1 000 r/min(离心半径10 cm)低速离心2 min，弃上清液，用接种环三线法将Hp菌株分离划线于哥伦比亚血琼脂平板，微需氧条件(10% CO2，5% O2，85% N2)，37 ℃培养48 h复苏Hp。将复苏的菌种在含万古霉素(Vancomycin，10 mg/L)、两性霉素B(Amphotericin B，10 mg/L)、多粘菌素B(Polymyxin B，2 500 U/L)、头孢氨苄-甲氧苄啶(TMP，5 mg/L)和7%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂平板上分区划线，微需氧环境(10% CO2，5% O2，85% N2)、37 ℃培养48 h。取单菌落进行生化反应、革兰染色和PCR扩增鉴定，鉴定为阳性后，用灭菌的生理盐水将Hp从血琼脂平板上洗下，调整菌液浓度至1×109CFU/mL。

1.2.2Hp感染小鼠模型的建立与分组

80只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为对照组和感染组，各40只。实验前24 h禁食，感染组灌胃Hp培养悬液(1×109CFU/mL，每只0.5 mL)，对照组灌胃等量磷酸盐缓冲液(PBS)。间隔48 h灌胃1次，共5次。实验期间自由饮食、饮水。

1.2.3Hp感染鉴定

末次灌胃后24 h，CO2麻醉处死两组各5只小鼠，无菌条件下解剖打开小鼠腹腔取出全胃，沿胃大弯解剖，用灭菌的PBS洗去胃内残留物，将胃黏膜置于液体尿素酶试剂中进行快速尿素酶试验，观察5 min，如试剂变为红色则表示阳性。

1.2.4PCR检测小鼠胃组织中NOD1和受体相互作用蛋白2(RIP2)mRNA的表达水平

末次灌胃后24、48、72、120 h各处死5只小鼠，解剖取其胃组织，加液氮研磨，TRIzol法提取小鼠胃组织总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，测定总RNA浓度和纯度，按照Fermantas RNA PCR(AMV)试剂盒说明书对RNA进行反转录为cDNA。PCR反应体系：25 mmol/L MgCl22 μL，5×PCR缓冲液4 μL，上下游引物各0.5 μL，聚合酶2 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O 9 μL；反应程序：94 ℃，2 min；94 ℃，40 s；50～65 ℃，40 s；72 ℃，1 min，30个循环，72 ℃，补延伸5 min，终止反应。PCR引物应用premier 6.0设计，序列见表1。PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结束后凝胶图像分析系统灰度扫描确定密度积分值。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，以目的基因产物电泳条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值来表示目的基因mRNA表达水平。

表1 引物序列

1.2.5Western blot检测小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65的表达水平

取部分胃组织置于匀浆器中，加入400 μL核蛋白提取液A液充分研磨，冰上作用15 min，4 ℃ 12 000 r/min(离心半径8 cm)离心2 min，弃上清液，加50 μL核蛋白提取液B液，轻轻吹打以重悬沉淀，冰上继续作用20 min，4 ℃ 12 000 r/min(离心半径8 cm)离心15 min,吸取上清液即为细胞核蛋白提取液，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，100 ℃使蛋白变性，10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳，结束后将蛋白转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，NF-κB p65一抗(1∶1 000)、Lamin B1一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，加电化学发光(ECL)检测的发光液反应，暗室中曝光显影，以目蛋白条带灰度值与内参Lamin B1条带灰度值的比值来表示目的蛋白相对表达水平，BandScan软件进行数据处理。

1.2.6ELISA检测小鼠血清IP-10及IFN-β水平

末次灌胃后8、12、16周两组各处死5只小鼠，采集其下腔静脉血，室温静置1 h，3 000 r/min(离心半径8 cm)离心10 min，上清液即为血清样品，酶标包被板上设空白孔、标准品孔和待测样品孔，空白孔不加样品和酶标试剂，标准品孔加入梯度稀释的标准品，待测样品孔先加样品稀释液40 μL，再加血清样品10 μL(最终稀释度为5倍)，轻轻晃动混匀，封板膜封板，37 ℃孵育30 min，洗涤液清洗5次，吸水纸上拍干，除空白孔外每孔加50 μL酶标试剂，封板膜封板，37 ℃孵育1 h，洗涤液清洗5次，吸水纸上拍干，每孔加入100 μL显色液TMB轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色20 min，待标准品孔前5孔出现明显的颜色梯度变化时，每孔加50 μL终止液终止反应，15 min内以空白孔调零，450 nm波长测量各孔的吸光度值(A值)，以标准品的浓度为横坐标，A值为纵坐标，使用CurveExpert软件绘制标准曲线，计算出样品浓度。

1.2.7苏木素-伊红(HE)染色镜检小鼠胃黏膜组织的病变程度

取灌胃Hp后第8、12、16周小鼠部分胃组织，10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片机切片厚度为4 μm，二甲苯、乙醇脱蜡、水化，HE染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶加盖玻片封片，显微镜下观察胃黏膜炎症情况并拍照保存结果，胃组织病理改变情况参照Miyashita标准进行评分[7]。

1.2.8流式细胞技术分析CD4+/CD8+T淋巴细胞比例

取灌胃Hp后第8、12、16周小鼠脾脏组织，用手术剪剪碎，70 μm筛网过滤后加入预冷的PBS混匀，1 500 r/min(离心半径8 cm)离心10 min，弃上清液，加入2 mL红细胞裂解液充分混匀，避光裂解10 min，1 500 r/min(离心半径8 cm)4 ℃离心5 min，弃上清液，PBS洗涤后重悬细胞，调整细胞浓度至1×106/mL，取300 μL细胞悬液至流式管，将FITC标记的兔抗鼠CD4、PE标记的兔抗鼠CD8加入管中混合均匀，同时设置不加抗体的空白对照组，4 ℃避光反应0.5 h，1 500 r/min(离心半径8 cm)4 ℃离心5 min，弃上清液，PBS洗涤后加入200 μL PBS将其重悬，上机检测，CellQuest软件分析数据并计算CD4+/CD8+T淋巴细胞百分比。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 Hp感染结果

对照组5只小鼠胃黏膜快速尿素酶试验均为阴性，感染率为0；感染组5只小鼠胃黏膜快速尿素酶试验均为阳性，感染率为100%。

2.2 各组小鼠胃组织中NOD1、RIP2 mRNA表达水平

Hp感染24 h后，与对照组比较，感染组小鼠胃组织NOD1 mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)，RIP2 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；Hp感染48、72、120 h后，与对照组比较，感染组胃组织NOD1、RIP2 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)；对照组NOD1、RIP2 mRNA表达水平随感染时间增加无明显变化，感染组NOD1 mRNA、RIP2 mRNA表达水平随感染时间增加先升高后降低，其中NOD1 mRNA在Hp感染48 h后表达水平最高，RIP2 mRNA在Hp感染72 h后表达水平最高，见表2，图1。

表2 各组小鼠胃组织中NOD1、RIP2 mRNA表达水平比较

图1 各组小鼠胃组织中NOD1、RIP2 mRNA的表达

2.3 各组小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65表达水平

Hp感染24、48、72、120 h后，与对照组比较，感染组小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65表达水平明显升高(P<0.05)；对照组小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65表达水平随感染时间增加无明显变化，感染组小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65表达水平随感染时间增加先升高后降低，在Hp感染72 h后表达水平最高，见表3，图2。

表3 各组小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65表达水平比较

图2 各组小鼠胃组织细胞核中NF-κB p65的表达

2.4 各组小鼠血清IP-10、IFN-β水平

Hp感染8、12、16周后，与对照组比较，感染组小鼠血清IP-10、IFN-β水平明显升高(P<0.05)；感染组小鼠血清IP-10、IFN-β水平随感染时间增加逐渐升高，在Hp感染16周后最高，见表4。

表4 各组小鼠血清中IP-10、IFN-β水平

2.5 HE染色观察小鼠胃黏膜组织病理变化

HE染色结果显示，对照组小鼠胃黏膜上皮结构完整，排列整齐，可见黏液细胞，无明显炎症损伤；Hp感染8、12和16周后，小鼠胃组织腺体结构破坏、减少、萎缩，肌层间质出现炎性细胞浸润，随着时间延长，胃黏膜病理损伤逐渐加重，见图3。感染8、12、16周后小鼠胃黏膜组织病理损伤评分分别为(2.31±0.21)、(3.68±0.35)、(4.73±0.37)分，差异有统计学意义(F=72.783，P<0.001)，且各组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

A：对照组；B：Hp感染8周；C：Hp感染12周；D：Hp感染16周。

2.6 各组小鼠脾脏组织CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比

Hp感染8周后，与对照组比较，感染组小鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞百分比无明显变化(P>0.05)，CD8+T淋巴细胞百分比明显升高(P<0.05)；Hp感染12、16周后，与对照组比较，感染组小鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞百分比明显降低(P<0.05)，CD8+T淋巴细胞百分比明显升高(P<0.05)；小鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞百分比随感染时间增加先降低后升高，在Hp感染12周后最低；小鼠脾脏组织CD8+T淋巴细胞百分比随感染时间增加先升高后降低，在Hp感染12周后最高，见表5，图4。

表5 各组小鼠脾脏组织CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比

A：对照组；B：Hp感染8周；C：Hp感染12周；D：Hp感染16周。

3 讨 论

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，据WHO统计，全世界胃癌患者约106.4万，死亡人数约78.3万，且均呈上升趋势，其中死亡人数约占癌症死亡总数的8.2%，病死率仅次于肺癌，居第2位[8]。胃癌产生的危险因素包括Hp感染、年龄、高盐摄入等，由内镜活检后组织学诊断，CT、内镜超声及腹腔镜等进行分期，是一种分子和表型高度异质的疾病[9]。胃癌的发病机制主要是原癌基因和抑癌基因的遗传及表观遗传学改变积累导致多种信号通路失调，从而打破细胞周期、细胞增殖与凋亡之间的平衡[10]。目前，手术是胃癌唯一的根治性治疗手段，随着外科手术、放疗、化疗的进步和新辅助疗法的实施，早期胃癌的5年生存率可达到95%以上，晚期胃癌主要采用新辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗的联合治疗方案[11]。分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的分子作为靶点，选择特异性阻断剂，对其进行有效控制，抑制肿瘤生长、转移和复发[12]。分子靶向治疗联合胃癌传统治疗效果显著，且毒副作用少。因此，研究胃癌的分子发病机制，寻找有效的新分子靶标对提高治疗效果具有重要意义。

Hp感染是导致十二指肠溃疡、胃癌及其他类型胃和胃外疾病的主要致病因素，占肠道型胃癌病例的近60%[13-14]。SAYED等[15]研究发现，Hp感染下调Nei样DNA糖基化酶2，导致基因组损伤增加，胃上皮细胞炎性反应放大并引发胃癌。LV等[16]研究显示，Hp感染诱导胃上皮细胞表达基质金属蛋白酶-10，可促进胃细菌定植和胃炎。SEMPER等[17]研究表明，Hp诱导白细胞介素(IL)-18以NF-κB依赖性方式抑制β-防御素1的表达，导致更多的细菌定植，同时炎症小体活化增强中性粒细胞浸润，从而导致炎症。本研究结果显示，正常小鼠经Hp感染后，胃组织腺体结构破坏、减少、萎缩，肌层间质出现炎性细胞浸润，血清IP-10、IFN-β水平升高，脾脏组织CD4+淋巴细胞百分比降低，CD8+T淋巴细胞百分比升高，提示Hp感染诱导小鼠产生炎性反应，降低其免疫功能。

NOD1主要表达于抗原呈递细胞和胃上皮细胞，此外在部分胃肠道细胞系中也有表达，在宿主防御病原体发生固有免疫应答中发挥重要作用。NOD1可以识别并结合革兰阴性细菌肽聚糖的保守结构，通过半胱天冬酶活化募集结构域发出信号后与接头蛋白RIP2相互作用[18]。NOD1/RIP2激活转录因子NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶，产生促炎性细胞因子及趋化因子[19]。ASANO等[20]研究发现，Hp感染通过NOD1介导的天然免疫反应调控尾型同源盒转录因子2的表达，引起肠上皮化生。TRAN等[21]研究表明，Hp通过激活NOD1和其配体相互作用的丝氨酸-苏氨酸激酶2信号，诱导IL-33反应。本研究结果显示，Hp感染组小鼠胃组织NOD1、RIP2 mRNA表达明显上调，细胞核NF-κB p65表达水平升高，提示Hp感染可以调控NOD1基因及下游相关分子的表达。

综上所述，NOD1及NF-κB的激活，可能参与Hp感染诱导小鼠产生炎性反应，致其免疫功能下降，为Hp感染导致胃癌的分子靶向治疗提供了理论依据。