绿僵菌与小檗碱复配制备水分散粒剂

杨 肖 葛喜珍 刘国新 田平芳*

(1.北京化工大学 生命科学与技术学院， 北京 100029； 2.北京联合大学 生物化学工程学院， 北京 100023；3.河北省化工研究院有限公司， 石家庄 050031)

引 言

金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是广谱昆虫病原菌[1]，可感染200多个种属的昆虫，其作为生物杀虫剂用于防治有害昆虫已有百年历史[2-4]。与化学农药相比，生物杀虫剂具有毒性小、专一性强、环境友好等优点，逐渐成为今后农业杀虫剂发展的趋势，具有广阔的应用前景[5]。近40年来，已经有80多种绿僵菌农药进行了登记，其制备工艺取得重要进展，不仅改进了传统粉状剂型，而且产生了许多能较好地适应环境变化的新剂型，例如油乳剂[6-7]、水剂[8]、颗粒剂[9]、乳粉剂[10]、悬乳剂[11]和微胶囊剂[12]等剂型。雷仲仁等[7]用绿僵菌LA06油剂防治东亚飞蝗(Locustamigratoriamanilensis)，当以V(大豆油)∶V(煤油)=3∶7配制油剂时，第18天虫口减退率达81.1%，虽然防治效果好，但其破坏环境且成本偏高。杨华等[12]用绿僵菌微胶囊剂对林间黄脊竹蝗(Ceracriskiangsu)跳蝻进行防治，防治效果达92.59%，但微囊剂的制备工艺复杂且成本较高。水分散粒剂(water-dispersible granule, WG)是遇水即迅速崩解并分散为悬液的粒状制剂[13-14]。与传统剂型相比，水分散粒剂具有粉尘少、成分均匀、流动性强、对环境友好等优点，并且对运输和包装的要求低。此外，水分散粒剂可兼容高浓度药物，许多不适合制备成粉剂或乳油的有效成分可采用该剂型。

小檗碱(berberine)又称黄连素，是从黄连(Coptischinensis)、黄柏(Phellodendronchinense)等药用植物中提取的一种季铵生物碱[15]。小檗碱在传统临床上用于治疗腹泻。此外，小檗碱还能有效抑制许多植物病原菌，例如白粉病菌等，因此作为天然农药得到了推广应用[16-19]。

早在上世纪70、80年代，许多化学农药出现抗药性，农药复配成为研发热点[20]。随着生物农药的不断出现，复配已不局限于化学农药，而是拓展到了生物农药，甚至是将化学农药和生物农药进行复配[21]。本课题组前期研究发现小檗碱在试验浓度下对很多真菌病原具有较强的抑制作用，而在相同浓度下对绿僵菌的生长没有明显抑制作用[22]。为了开发既抗虫又抗病的双效制剂并降低田间施药成本，本文将绿僵菌与小檗碱复配，制备了水分散粒剂。测定了小檗碱对绿僵菌的有效中浓度(EC50)，通过单因素试验及响应面法分析筛选合适的载体以及润湿剂、分散剂、黏结剂、崩解剂等助剂。以筛选的配方制备的水分散粒剂，其质量检测结果符合相关行业标准。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1供试菌种和小檗碱

金龟子绿僵菌CQMa421孢子粉(含水量2.39%，孢子萌发率90.02%，含孢量4.26×1010cfu/g，杂菌率1.32%)，重庆聚立信生物工程有限公司；小檗碱(含量97%)，陕西慧科植物开发有限公司。

1.1.2供试载体和助剂

载体 硅藻土、滑石粉、高岭土、白炭黑，均为药用级，上海麦克林生化科技有限公司。

润湿剂 十二烷基硫酸钠(SDS)(分析纯)、十二烷基磺酸钠(SDBS)(分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司；拉开粉BX(化学纯)、脂肪醇聚氧乙烯醚JFC- U(日化级)，山东优索化工科技有限公司；乳化剂NP- 10(分析纯)，无锡市亚泰联合化工有限公司；润湿剂HR- 3408，吉水文山航润化工厂。

分散剂 木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、亚甲基二萘磺酸钠(NNO)、亚甲基双甲基萘磺酸钠(MF)，均为化学纯，上海麦克林生化科技有限公司；羟丙基纤维素(HPC)Ⅱ型，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

黏结剂 糊精(生物试剂)、马铃薯淀粉(生物试剂)，北京索莱宝科技有限公司；聚乙烯醇1799(化学纯)、明胶(生物试剂)，上海麦克林生化科技有限公司；聚乙二醇(平均数均分子量10 000)、羧甲基纤维素钠(黏度1 000～1 400 mPa·s)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

崩解剂 海藻酸钠(分析纯)，上海源叶生物科技有限公司；可溶性淀粉(分析纯)，北京索莱宝科技有限公司；尿素(分析纯)、氯化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸钠(分析纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基 将200 g马铃薯切成小块，水煮(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用8层纱布过滤。加入葡萄糖20 g溶解，再加入琼脂粉20 g溶解。加水至1 000 mL，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

液体培养基 蛋白胨1 g，酵母粉1 g，葡萄糖4 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.1 g，KCl 0.1 g，加入蒸馏水200 mL，115 ℃灭菌20 min。

1.2 实验仪器

XB- K- 25型血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公司；YKY- 700型光学显微镜，上海永科光学仪器有限公司；LSHE- 600型生化培养箱，上海勒丰实业有限公司；标准检验筛，40目(筛孔径0.425 mm)，浙江上虞市公路仪器厂；WD101A型烘箱，天津市中环实验电炉有限公司；KLJ- 150型粉末造粒机，广州市大祥电子机械设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1小檗碱对绿僵菌的EC50测定

将小檗碱粉末加入到PDA培养基中，配制含药固体培养基，质量浓度梯度设为0、200、400、600、 800、1 000、2 000、3 000 μg/mL，每个质量浓度重复测试3次。用打孔器从生长绿僵菌的PDA培养基上打取菌饼，接种到含小檗碱平板的中心处，恒温培养箱正面放置，于26 ℃静置培养，7 d后用十字交叉法测量菌丝直径，采用菌丝生长抑制法计算小檗碱对绿僵菌的EC50[23]。

1.3.2待测样品制备

载体筛选 70%(质量分数，下同)载体、30%绿僵菌孢子粉；

润湿剂筛选 25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱，不同种类润湿剂的含量分别为1%、3%、5%，硅藻土补足100%；

分散剂筛选 25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱、3%乳化剂NP- 10，不同种类分散剂的含量分别为1%、3%、5%，硅藻土补足100%；

黏结剂、崩解剂筛选 25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱粉、3%乳化剂NP- 10、崩解剂与黏结剂各10%，硅藻土补足100%。

将以上各组成分充分混匀，室温保存一个月，作为待测样品。

1.3.3生物相容性测定

将上述待测样品粉末制成悬液，以纯孢子悬液为对照(每毫升孢子数为103个)，测定其生物相容性。

孢子萌发率 将500 μL待测样品滴加至含有100 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，于160 r/min、(25±1)℃培养16 h。在光学显微镜下用血球计数板统计总孢子数和萌发孢子数，设置5个重复，按照式(1)计算孢子萌发率。

G=(X1/X0)×100%

(1)

式中，G为孢子萌发率，X1为发芽孢子数，X0为孢子总数。

菌丝生长速率[24]配制PDA培养基，115 ℃高压蒸汽灭菌，倒板凝固后，在固体培养基中间打孔，接种上述待测样品悬液20 μL，每个载体处理5个平板，以不加载体的培养基作为对照组。(25±1)℃下培养10 d，用游标卡尺测量菌丝直径，按照式(2)计算菌丝生长速率。

Φ1=Φ2/10

(2)

式中，Φ1为菌丝生长速率，mm/d；Φ2为菌丝直径，mm。

产孢量 在上述菌丝半径的1/2处用打孔器取3次样，置于0.05%吐温80的无菌水中，加入适量小玻璃珠，160 r/min振荡2 h，使孢子充分散开，在光学显微镜下用血球计数板计数，按照式(3)计算产孢量。

C=X0/S

(3)

式中，C为产孢量，S为菌饼面积。

1.3.4载体和助剂的筛选

为了获得最佳成分组合，减少试验次数，通过单因素试验，确定载体和润湿剂的种类与用量。对于分散剂、崩解剂、黏结剂的种类与用量，先通过生物相容性试验进行粗筛，然后使用Box- Behnken响应面法进行优化，最终确定分散剂、崩解剂、黏结剂的用量。

1.3.5水分散粒剂制备

按照确定的比例将绿僵菌孢子粉和小檗碱充分混匀，制成母粉。在母粉中按照筛选好的处方比例添加润湿剂、分散剂、崩解剂，最后用载体补足全量，混匀后喷入黏结剂的水溶液，使混合物的含水量保持在30%(质量分数)。加入粉末造粒机中造粒，于35 ℃低温干燥，以水分≤5%为干燥终点，得到绿僵菌与小檗碱复配的水分散粒剂。

1.3.6水分散粒剂的质量评价方法

崩解时间 在25 ℃下，向含有90 mL蒸馏水的具塞量筒(100 mL，内高22.5 cm、内径28 mm)加入0.5 g水分散粒剂(粒径250～1 410 μm)，塞住筒口，夹住量筒中部，以8 r/min的速度旋转，一般以样品在水中完全崩解(无可见颗粒)的时间小于3 min为测试合格。

润湿时间和含水量 按照GB/T 5451—2001[25]测定润湿时间，按照 GB/T 1600—2001[26]中的“共沸蒸馏法”测定含水量。

悬浮率和杂菌率 按照 GB/T 14825—2006[27]测定悬浮率，按照NY/T 3282.1—2018[28]测定杂菌率。

1.3.7数据统计与分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0软件进行数据处理，结果以“平均值±标准差”表示。使用Duncan法进行多重比较分析，P<0.05说明差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 载体筛选结果

由于分散剂中载体的添加量较大，故载体的选择要综合考虑其理化性质、生物相容性及成本等因素[29-31]。表1为不同种类的载体对绿僵菌生长的影响。

表1 载体对绿僵菌的影响

标有不同字母者代表组间差异显著(P<0.05)，标有相同字母者代表组间差异不显著(P>0.05)，下同。

通过表1结果可知，滑石粉和白炭黑的孢子萌发率与产孢量均显著低于对照组(不含载体)，说明二者与绿僵菌的生物相容性较差，推测可能与两种载体的性能有关：滑石粉的pH值在6～10之间，白炭黑的pH值在3.5～4.6之间，偏酸性或偏碱性均不利于孢子生长。硅藻土和高岭土的孢子萌发率和产孢量与对照组相比无明显差异，而硅藻土的菌丝生长速率显著高于高岭土，同时考虑到硅藻土的密度小、吸水量大，因此选择硅藻土作为水分散粒剂的载体。

将绿僵菌孢子粉以40%、35%、30%、25%、20%的添加量(质量分数，下同)加入筛选的硅藻土载体中，混匀后测定润湿时间，结果见图1。湿润时间随着孢子粉添加量的增大而增大。参考行业标准NY/T 3282.3—2018[32]对润湿时间的要求(小于2 min)，当孢子粉的添加量为25%时，湿润时间为243 s。考虑后续添加润湿剂可以减少湿润时间，同时为了尽量保证含药量大，确定绿僵菌孢子粉的添加量为25%。

图1 不同绿僵菌孢子粉添加量下的润湿时间Fig.1 Wetting time with different amounts of M. anisopliae conidia

图2 不同质量浓度的小檗碱对绿僵菌生长的影响Fig.2 Effect of different mass concentrations of berberine on the growth of M. anisopliae

2.2 EC50测定结果和小檗碱用量的确定

2.2.1EC50测定结果

图2为不同质量浓度的小檗碱对绿僵菌生长的影响。由结果可知，绿僵菌在含有不同质量浓度的小檗碱的培养基中生长情况不同，随着小檗碱质量浓度的增大，绿僵菌的菌丝生长变慢。按照1.3.1节的方法计算小檗碱对绿僵菌的EC50，几率值可从生物统计机率值换算表[33]中查找，得出EC50=47.2 mg/mL。此值每毫升达到了毫克级，表明小檗碱对绿僵菌的生长无明显抑制作用。

2.2.2小檗碱用量的确定

有研究发现小檗碱可强烈抑制桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)，EC50为4.69～8.72 μg/mL[16-17]。以往田间试验发现金龟子绿僵菌CQMa421防治白背飞虱[34]、甘蓝菜青虫和小菜蛾[35]、苹果桃小食心虫和草地蝗虫[36]以及辣椒病毒病[37]的最适施药浓度为(2.5～3.33)×106cfu/mL，防效可达88.35%～93.08%。根据绿僵菌分生孢子的最适施药浓度为(2.5～3.33)×106cfu/mL时小檗碱用量可达到10 μg/mL，计算出小檗碱的添加量为2.66%～3.54%(质量分数，下同)，为便于计算和操作，本文选取3%的添加量。

2.3 助剂筛选结果

2.3.1润湿剂

润湿剂的润湿能力因种类和浓度不同而存在差异。表2为润湿剂的种类和添加量对润湿时间和孢子萌发率的影响。当不添加润湿剂(对照组)时，绿僵菌孢子粉和载体的润湿时间超过2 min。当润湿剂的添加量为1%时，只有SDBS和BX的润湿性不满足行业标准[32]的要求，JFC- U和HR- 3408的润湿时间最短，分别为8 s和25.25 s。当润湿剂的添加量为3%时，除JFC- U组外，其他实验组的润湿时间与1%添加量相比均有所缩短，并且润湿时间降幅较大，其中BX的润湿时间减至120 s以内。当润湿剂的添加量为5%时，只有BX和NP- 10较添加量为3%时润湿时间降幅较大。进一步考虑润湿剂与分生孢子的生物相容性，当润湿剂的添加量为1%时，除BX和NP- 10外，其他实验组和对照组之间的孢子萌发率均存在显著差异。随着润湿剂添加量的增加，孢子萌发率总体上有所减小。只有添加量为1%的BX组以及添加量为1%～5%的NP- 10组符合行业标准[32]对孢子萌发率的要求(≥85%)。

表2 润湿剂的种类和添加量对润湿时间和孢子萌发率的影响

综合润湿时间和生物相容性，并兼顾后续助剂及制备过程对孢子活性的影响，确定润湿剂种类为NP- 10，其添加量为3%，此时测得的孢子萌发率达91.52%，润湿时间为63.25 s。

2.3.2分散剂

表3为分散剂的种类和添加量对悬浮率和孢子萌发率的影响。当MF的添加量为1%～5%时，悬浮率均高于其他分散剂，说明MF的分散能力较强。当分散剂的添加量为1%和3%时，各分散剂组与对照组(不含分散剂)的孢子萌发率无显著差异；当分散剂的添加量为5%时，只有MF与对照组的孢子萌发率有显著差异(F=3.942，P<0.05)。因为分散剂均不能满足行业标准[32]对悬浮率的要求(≥80%)，故将悬浮性能最好的两种分散剂MF和木质素磺酸钙进行复配：2%MF+5%木质素磺酸钙，此时测得的悬浮率为81.34%，孢子萌发率为86.45%，满足相关行业标准的要求，因此确定以MF和木质素磺酸钙的质量比为2∶5的混合物作为制剂的分散剂。

表3 分散剂的种类和添加量对悬浮率和孢子萌发率的影响

2.3.3黏结剂和崩解剂

图3为不同黏结剂和崩解剂对绿僵菌的生物相容性。各实验组和对照组的孢子萌发率均有显著差异。糊精、马铃薯淀粉、聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠的孢子萌发率高于其他黏结剂；海藻酸钠与氯化钠的孢子萌发率高于其他崩解剂。结果表明这些助剂的生物相容性较好，可进行下一步粗筛。

标有不同字母者代表组间差异显著(P<0.05)，标有相同字母者代表组间差异不显著(P>0.05)。图3 黏结剂和崩解剂与绿僵菌的生物相容性Fig.3 Biocompatibility of binders and disintegrants with M. anisopliae

使用1.3.5的方法制备水分散粒剂，测定不同黏结剂(糊精、马铃薯淀粉、聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠)的崩解性能，并且将所制备的颗粒的性状与市售的同种剂型(70%吡虫啉水分散粒剂，江西禾益化工股份有限公司)进行粗略对比，结果见表4。与市售制剂相比，用糊精和马铃薯淀粉制备的颗粒偏硬，结块严重，导致崩解迟缓；以聚乙烯醇为黏结剂时，颗粒粉末较多，且易碎；以羧甲基纤维素钠为黏结剂时，颗粒硬度适中。因此本文选择羧甲基纤维素钠为最优黏结剂。表5 为不同添加量的羧甲基纤维素钠对崩解时间和颗粒性状的影响。崩解时间随着羧甲基纤维素钠添加量的增加而增加；当羧甲基纤维素钠的添加量为3%时，水分散粒剂的颗粒硬度适中。

表4 黏结剂筛选

表5 羧甲基纤维素钠的添加量筛选

表6为海藻酸钠和氯化钠对崩解时间的影响。使用海藻酸钠为崩解剂时，制剂的崩解时间比氯化钠制成的制剂短。由表7可知，当海藻酸钠的添加量为2%和6%时，制剂的崩解时间大于10 min，原因是崩解剂的添加量太少造成崩解迟缓。随着崩解剂添加量的增加，制剂的崩解性能逐渐提高，当崩解剂的添加量为10%和15%时，崩解时间较短，分别为360.48 s和228.48 s。

表6 崩解剂筛选

表7 海藻酸钠的添加量筛选

2.4 Box- Behnken响应面法试验设计与结果

为了进一步优化制剂的处方，以单因素试验结果为基础，根据Box- Behnken采样原理，以木质素磺酸钙添加量、羧甲基纤维素钠添加量、海藻酸钠添加量为变量(后期为保证悬浮率合格，根据木质素磺酸钙含量添加MF)，以崩解时间为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验(表8)，试验方案及结果如表9所示。

表8 各因素编码和水平

表9 试验方案与结果

使用Design-Expert 10.0.1分析试验结果，获得二次多项式回归方程：

Y=224-2.12A+78.38B-51.50C-0.5AB-0.75AC-0.75BC+39.5A2+40.5B2+41.75C2

式中，Y为崩解时间，A为木质素磺酸钙添加量，B为羧甲基纤维素钠添加量，C为海藻酸钠添加量。

响应面模型的方差分析结果如表10所示。回归模型的P<0.000 1，失拟项的P>0.05，此值不显著，说明模型的预测值和真实值之间的拟合度较高。该模型的复相关系数R2=0.999 8，表明该模型可以解释响应面中99.98%的可变性。模型中自变量A、B、C、A2、B2、C2的P值达到极显著水平，说明分散剂添加量、黏结剂添加量和崩解剂添加量对制剂崩解性能的影响最为显著，且各影响因素和响应值之间不是线性关系。根据F值大小，确定这3个因素对崩解时间的影响程度大小是：B>C>A。

表10 响应面模型的方差分析结果

根据建立的回归模型，得出最优处方为：分散剂添加量A为5.267%，黏结剂添加量B为1.667%，崩解剂添加量C为18.333%。在此条件下模型预测的崩解时间为174.702 s。根据软件预测结果并考虑实际工艺设置，选取分散剂添加量A为5.3%、黏结剂添加量B为1.7%、崩解剂添加量C为18%，进行3次重复试验，测得平均崩解时间为178 s，与模型预测的结果接近，表明基于该响应面模型分析优化崩解时间的方法有效可行。

2.5 水分散体粒剂粒径与崩解时间的关系

表11为不同粒径的水分散体粒剂对崩解时间的影响。结果表明，水分散体粒径为0.8 mm时，崩解时间<180 s；粒径大于0.8 mm时，崩解时间>180 s，原因是较大的粒径与水接触的相对表面积较小。因此本文最终选择粒径为0.8 mm的颗粒。

表11 不同粒径的水分散粒剂对崩解时间的影响

综上，绿僵菌与小檗碱复配为水分散粒剂的最佳配方为：25%绿僵菌孢子粉、3%小檗碱、3%润湿剂NP- 10、2.1%分散剂MF、5.3%分散剂木质素磺酸钙、18%的崩解剂海藻酸钠、1.7%的黏结剂羧甲基纤维素钠，用载体硅藻土补足100%。按照1.3.5的方法，将各种组分按比例混合均匀，喷入黏结剂，放入造粒机中造粒，选择粒径0.8 mm的颗粒，于35 ℃干燥后过40目筛，得到绿僵菌与小檗碱复配的水分散粒剂。经测定，所制备的水分散粒剂的平均崩解时间为174 s，孢子萌发率为85.4%，孢子悬浮率为86.34%，含水量为1.88%，杂菌率2.01%，符合相关行业标准。

3 结论

(1)本文将绿僵菌与小檗碱复配，测定了小檗碱对绿僵菌的EC50为47.2 mg/mL，表明小檗碱对绿僵菌没有明显的抑制作用，二者可以复配；根据以往绿僵菌的田间试验及小檗碱的抗真菌实验，确定小檗碱的添加量为3%；通过处方筛选试验，最终确定水分散粒剂的配方为：25%绿僵菌孢子粉，3%小檗碱，3%NP- 10(润湿剂)，2.1%MF(分散剂)，5.3%木质素磺酸钙(分散剂)，18%海藻酸钠(崩解剂)，1.7%羧甲基纤维素钠(黏结剂)，硅藻土(载体)补足100%。

(2)按照确定的配方加入绿僵菌孢子粉和小檗碱的母粉、润湿剂、分散剂、崩解剂及载体，混匀后喷入黏结剂水溶液，使含水量保持在30%。加入造粒机中造粒，选择粒径0.8 mm的颗粒，于35 ℃低温干燥以尽量保证孢子活力，以水分≤5%为干燥终点，过40目筛，得到绿僵菌与小檗碱复配的水分散粒剂。经质量检测，所制备的水分散粒剂的平均崩解时间为174 s，孢子萌发率为85.4%，孢子悬浮率为86.34%，含水量为1.88%，杂菌率为2.01%，符合相关行业标准。