基于响应面法优化无糖益生菌牛奶片配方

任敏，李志国，闫清泉，边燕飞，司阔林，宗学醒

内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司（呼和浩特 011500）

牛奶片作为一种营养价值高、方便携带的休闲乳制品，以便捷的方式帮助补充人体所需的蛋白质、钙等营养素，因此受到广大消费者特别是儿童的喜爱[1]。目前市场上大多的奶片产品添加糖含量在7%～ 10%，有研究表明，蔗糖可能比其他糖类更容易引起龋齿，这是因为大多数口腔细菌仅通过蔗糖就能合成可溶性和不可溶性胞外聚合物，从而增加菌斑的体积，促进细菌附着，进而导致龋齿[2]。此外，高糖食品还是引起现代人群罹患2型糖尿病、肥胖症、心血管疾病等的重要原因之一[3-4]。

低糖或无糖食品常使用赤藓糖醇、木糖醇替代白砂糖，其中赤藓糖醇具有高热稳定性、甜味协调、零热值、无致龋齿性、不会引起血糖升高等优势，甜度相当于蔗糖的70%，与其他糖醇相比，赤藓糖醇耐受性最高[5-7]。李家磊等[8]以赤藓糖醇和木糖醇的混合甜味剂研制薏苡仁多糖奶片。Shu等[9]基于响应面分析，确定木糖醇、赤藓糖醇、甘露糖醇等在益生菌羊奶片中的最优配比。值得注意的是，赤藓糖醇溶解热较高，添加量过高会带来清凉口感，不同于蔗糖带来的甜熟感[10]。罗汉果甜苷是一种天然甜味剂，甜度为蔗糖的200～300倍，不引起龋齿和血糖变化[11-12]。相较于甜菊糖苷，罗汉果甜苷的甜味释放缓慢，保留时间长、苦味弱[13-14]，被视为新一代功能性天然甜味剂。孙常文等[6]研究表明赤藓糖醇与高倍甜味剂复合使用口感近似蔗糖，且能够改善甜味剂后甜浓烈甚至苦味。而使用赤藓糖醇和罗汉果甜苷复配制备无糖奶片的研究还鲜有报道。

随着生活质量的不断提高，消费者对于休闲乳制品的需要逐渐向具有合理营养和保健功能的方向发展。近些年对于益生菌奶片产品的研究也日益增多，益生菌奶片既具有牛奶的营养价值，又具有益生菌独特的生理功能，而与液体益生菌口服液相比，益生菌奶片具有方便携带、贮藏和运输等优势[15-18]。

试验通过对全脂乳粉、赤藓糖醇和罗汉果甜苷3个因素的不同添加量进行研究，确定这些因素的最佳添加量，并进行响应面试验，得到无糖益生菌牛奶片的最佳配方，验证该配方下牛奶片的感官评分及贮藏期间活菌数的变化情况，以期为无糖益生菌牛奶片的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

全脂乳粉（新西兰恒天然）；低聚果糖，赤藓糖醇（保龄宝生物股份有限公司）；罗汉果甜苷V55（食品级，华诚生物）；双歧杆菌BB12（科汉森）；脱盐乳清粉，硬脂酸镁（市售）。

1.2 仪器与设备

电子天平（PG6002-S，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；筛网（0.150 mm，即100目，浙江上虞市道墟张兴纱筛厂）；压片机（90L-4，台州市路桥区恒列电机有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 无糖益生菌牛奶片制备的工艺流程

原料粉碎过筛→称量、配料→混合均匀→压片

1.3.2 单因素试验方法

在预试验基础上（全脂乳粉65%，脱盐乳清粉22.69%，低聚果糖5%，赤藓糖醇6%，罗汉果甜苷0.01%，双歧杆菌1%，硬脂酸镁0.3%），将全脂乳粉、赤藓糖醇和罗汉果甜苷3个因素中的2个因素固定，设置另一个因素的变化，进行单因素试验，按照感官评定方法对样品进行评价。

1.3.2.1 全脂乳粉添加量的确定

全脂乳粉为制作奶片的主要原料，是奶香味的主要来源，按照物料质量的50%，55%，60%，65%和70%进行添加。

1.3.2.2 赤藓糖醇添加量的确定

赤藓糖醇作为奶片中的代糖成分，是奶片甜感的主要来源，按照物料的4%，5%，6%，7%和8%进行添加。

1.3.2.3 罗汉果甜苷添加量的确定

罗汉果甜苷作为天然高倍甜味剂，对产品的甜味起到补充作用，影响奶片的甜味协调性，按照物料的0.005%，0.01%，0.015%，0.020%和0.025%进行添加。

1.3.3 感官评价的标准

挑选10名具有感官品评课程学习经历的研发工程师组成感官评定小组（五男五女），对奶片进行品评，按照表1标准进行打分[19-20]。

表1 感官评分表

1.3.4 Box-Behnken试验

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[21]，以全脂乳粉、赤藓糖醇和罗汉果甜苷为因子，所制备的无糖益生菌牛奶片感官评分为指标，设计三因素三水平响应面分析试验，数据用Design- Expert 13.0软件分析确定最优配方组合，因素与水平见表2。

表2 因素水平编码表 单位：%

1.4 验证试验

根据优化后的试验结果，将选中的3个因素的最佳添加量再次进行试验，重复验证3次，验证试验结果是否准确。

1.5 贮藏期间益生菌活菌数测定

对优化配方后的无糖益生菌牛奶片产品进行双歧杆菌的活菌数监测。贮藏条件为常温、避光、阴凉放置6个月，每隔1月检测1次，检测方法参考GB 4789.34—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》。

1.6 数据分析

采用Design-Expert V 13.0软件进行统计分析，结果用“平均值±标准差”表示，采用Graph pad prism 6作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1为单因素试验结果。如图1（A）所示，全脂乳粉添加量在50%～60%，奶片的感官评分随着全脂乳粉添加量增加而上升，这是由于全脂乳粉添加量增加，增强奶片的乳香味，从而使感官评分较高；全脂乳粉添加量60%时，感官评分最高，为89.2±0.91分；全脂乳粉添加量超过60%后，奶片感官评分随着全脂乳粉添加量增加而降低，这可能是由于全脂乳粉添加量过高，导致奶片粘牙，进而导致感官评分较低。因此，全脂乳粉添加量60%为宜。

图1（B）为赤藓糖醇添加量与奶片感官评分之间的关系。随着赤藓糖醇添加量增加，奶片感官评分呈现先上升后降低趋势，赤藓糖醇添加量5%时，奶片感官评分最高，为85.2±1.42分，赤藓糖醇添加量低于5%时奶片甜味不足，添加量超过5%后，随着赤藓糖醇添加量的增加，清凉口感较为明显，导致感官评分较低。因此，初步选定赤藓糖醇添加量为5%。

图1（C）表明，罗汉果甜苷添加量0.01%时感官评分最高，罗汉果甜苷添加量低于0.01%时甜味不足，高于0.01%时，随着添加量增加，奶片甜味增强尤其是后甜绵长且浓烈，导致感官评分较低。因此，选择罗汉果甜苷添加量0.01%为宜。

图1 单因素试验结果

2.2 响应面试验结果

响应面法优化无糖益生菌牛奶片的试验结果见表3。

表3 响应面设计及结果

2.2.1 回归方程的建立和显著性分析

响应面法优化无糖益生菌牛奶片的工艺结果见表4。对各因素回归拟合后，获得感官评分（Y）的三元二次回归方程：Y=91.24+2.11A-2.52B-2.96C-0.6AB-2.13AC-2.7BC-5.23A2-7.96B2-7.13C2。

对该回归模型进行方差分析，结果见表4。试验建立的回归模型p值＜0.000 1，达到极显著水平，其中，失拟项（p=0.071 4＞0.05）不显著，说明模型拟合程度良好。模型校正系数R2=0.981 4，模型修正系数Radj2=0.957 5，说明回归模型与预测值之间有良好的拟合程度，全脂乳粉、赤藓糖醇和罗汉果甜苷的添加量与感官评分之间的线性关系显著。因此，该模型可用于理论预测。

由表4中的回归系数显著性的检验可以表明，A、B、C与二次项A2、B2、C2及交互项BC对产品感官评分有极显著影响，交互项AC对产品感官评分有显著影响。由表4中F值的大小可以判断各因素对无糖益生菌牛奶片感官评分影响的强弱，F值越大，对感官评分影响作用越强[22]，3个因素对感官评分的影响大小为C＞B＞A，即罗汉果甜苷添加量＞赤藓糖醇添加量＞全脂乳粉添加量。

表4 回归模型与方差分析

2.2.2 响应曲面分析

通过响应面分析能够更直观地反映出两两因素的交互作用，通过经Design Expert 13.0软件进行二次多元回归设计便可作出各因素间相互交互作用的三维立体响应曲面和等高线图，如图2～图4所示，响应面图均为顶部凸起、开口朝下的曲面，表明感官评分存在极值，该值为响应面的最高点，而且各个因素的最佳作用点都在试验设计的范围之内。

图4 赤藓糖醇与罗汉果甜苷添加量的相互作用对奶片感官评分的响应面图

由图2等高线分析可知，赤藓糖醇添加量不变时，沿着全脂乳粉添加量变化的方向看，赤藓糖醇添加量的等高线较密，说明赤藓糖醇添加量对奶片感官评分的影响较显著。整体来看，因素A与B之间相互作用的等高线椭圆弧度较小，3D曲线较平缓，表明全脂乳粉与赤藓糖醇添加量之间的交互作用不显著。

图2 全脂乳粉与赤藓糖醇添加量相互作用对奶片感官评分的响应面图

图3为全脂乳粉添加量（A）与罗汉果甜苷添加量（C）之间的交互作用响应图。全脂乳粉添加量较低时，随着罗汉果甜苷添加量升高，感官评分呈现迅速上升然后降低趋势，变化幅度明显；全脂乳粉添加量处于中等或较高时，随着罗汉果甜苷添加量增加，感官评分呈现缓慢上升然后下降趋势。这是由于罗汉果甜苷添加量过高，会导致奶片甜味太持久导致感官评分降低。研究表明，单一甜味剂在食品中的应用大多存在后味持久等现象，因此需要与其他甜味剂复配来解决这一问题[23-24]。罗汉果甜苷添加量较低时，随着全脂乳粉添加量的增加，感官评分呈现迅速上升然后缓慢下降趋势，上升幅度明显；罗汉果甜苷添加量处于中等或较高水平时，感官评分随着全脂乳粉添加量的增加而缓慢上升然后下降。全脂乳粉添加量（A）与罗汉果甜苷添加量（C）之间的交互作用较为显著。

图3 全脂乳粉与罗汉果甜苷添加量的相互作用对奶片感官评分的响应面图

赤藓糖醇与罗汉果甜苷添加量的相互作用如图4所示。赤藓糖醇添加量不变，随着罗汉果甜苷添加量增加，感官评分呈现快速上升然后降低趋势，升高幅度明显；同样，罗汉果甜苷添加量不变，随着赤藓糖醇添加量增加，感官评分呈现先快速上升然后下降趋势，升高幅度明显。从整体曲线的状态来看，3D曲线较陡，等高线椭圆弧度最大，表明赤藓糖醇添加量（B）与罗汉果甜苷添加量（C）之间的交互作用极显著。

2.2.3 验证试验

通过对响应面数据的分析可以得出无糖益生菌牛奶片的最佳配方：全脂乳粉添加量65%、赤藓糖醇添加量4.86%、罗汉果甜苷添加量0.008%。在此配方下，无糖益生菌牛奶片的感官评分为89.2分。在各因素最佳添加量的条件下进行3次平行试验，无糖益生菌牛奶片的感官评分为90.2±0.52分，相对误差为1.12%，与预测值无显著差异，表明采用响应面法优化得到的无糖益生菌牛奶片最佳配方是可靠的。

2.2.4 贮藏期间益生菌活菌数的变化情况

按照响应面法优化后的配方制备无糖益生菌牛奶片，测定贮藏6个月期间牛奶片的双歧杆菌活菌数情况，结果如图5所示。结果表明，无糖益生菌牛奶片在贮藏180 d期间，活菌数呈现下降趋势，在前90 d下降速度较快，之后趋于平缓。贮藏180 d后，活菌数可达2.1×107±0.17 CFU/g，且在整个贮藏期间活菌数均在107CFU/g以上。马强[16]对添加益生菌粉直接压片得到的益生菌奶片中的活菌数进行监测，结果表明，奶片初始活菌数可达到108CFU/g，常温贮藏6个月后的活菌数能保持在106CFU/g，与试验结果相近。国际乳业联合会（IDF）规定，具有益生功效的食品中至少要有107CFU/g的活菌数。研究表明，按消费者日常摄入100 g计算，相应的产品中益生菌含量必须大于106mL-1才能发挥益生功效[25-26]。因此，优化后的配方能够保证无糖益生菌牛奶片发挥益生功效。

图5 贮藏期间无糖益生菌牛奶片双歧杆菌活菌数的变化

3 结论

通过单因素试验及响应面分析建立无糖益生菌牛奶片感官评分与全脂乳粉添加量、赤藓糖醇添加量和罗汉果甜苷添加量之间的回归模型，得到无糖益生菌牛奶片的最优配方：全脂乳粉添加量65%、赤藓糖醇的添加量4.86%、罗汉果甜苷添加量0.008%，该配方下奶片的感官评分最高。在该配方下，无糖益生菌牛奶片的感官评分为90.2±0.52分，相对误差为1.12%，与预测值无显著差异。赤藓糖醇与罗汉果甜苷之间的甜味协同作用能够较好地替代白砂糖，为无糖奶片的研究提供一种可行性方案。通过对奶片贮藏期间双歧杆菌活菌数的监测，在贮藏6个月期间，奶片中的双歧杆菌活菌数均在107CFU/g以上。试验结果表明，优化后的无糖益生菌奶片感官品质良好，且具备益生功效，可为无糖益生菌牛奶片的工业化生产提供数据支持。