基于UPLC-Orbitrap-HRMS技术的苎麻籽乙醇提取物中主要化学成分分析与鉴定

熊蓥姿，赵振，成婧，李佳银，罗磊，李跑，李脉泉，刘霞*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）（2.长沙海关技术中心，食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004)

苎麻为荨麻科苎麻属生宿根性草本植物，主要分布在亚热带和热带地区，在我国湖南、云南、四川等省份均有种植[1]。苎麻茎皮拥有优质植物纤维，是重要的纺织工业原料，其根和叶是我国传统中药，有活血、安胎等功效[2]。现代研究主要致力于苎麻根、叶中的功能成分分析，特别是黄酮类化合物具有多种生物活性，一直是其研究的热点[3，4]。目前已经从苎麻中分离鉴定出十余种黄酮化合物，苎麻叶中主要有芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、野漆树苷等，苎麻根中主要有芦丁、槲皮素、紫杉叶素、紫云英苷、表儿茶素等[5-7]，且研究表明，苎麻属黄酮类化合物具有一定抗氧化[4]、抗炎、抗菌[8]、抑制乙肝病毒活性[9]的能力。但是对于苎麻籽的研究较少，现有的报道也只限于关于苎麻籽油的研究，研究发现苎麻籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸[10，11]。

超高效液相色谱-离子阱-超高分辨率质谱技术（Ultra Performance Liquid Chcromatography-Orbitrap-High Resolution Mass Spectrometer，UPLC-Orbitrap-HRMS）技术是近几年发展起来的分离鉴定技术，具有超高压、超高灵敏度，超高分离度等诸多优点。该技术在单个分析周期内即可完成对样品高通量、高精度的一级、二级扫描，并且对复杂的样品也可提供灵敏和可重复的监测，获得精确质量数，实现多种物质的定性、定量和确证分析[12，13]。毛祈萍等[14]基于超高效液相色谱和飞行时间质谱联用对紫苏化学成分进行鉴定，总共鉴定出 51个成分。本研究首先通过 1，1-二苯基-2-吡啶并肼基-高效液相色谱（ 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl-High performance liquid chromatography，DPPH-HPLC）方法，发现苎麻籽乙醇提取物中，存在多种抗氧化活性成分。随后，通过扫描相应色谱峰的紫外吸收光谱，初步推断其抗氧化活性成分多为黄酮类化合物。然后采用 UPLC-Orbitrap-HRMS对苎麻籽的乙醇提取物进行进一步的分析，结合标准品的质谱数据、相关文献和MsBank、mzCloud质谱数据库，对样品质谱信息进行解析，推断其可能存在的化合物，并对其中部分化合物的质谱裂解途径进行了分析，为苎麻籽的开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苎麻籽（品种为湘苎三号，湖南长沙湖南农业大学苎麻研究所“湘苎三号”原种基地）由湖南农业大学苎麻研究所提供，于2019年1月初采收。经清洗、干燥、粉碎、过60目筛后制成苎麻籽粉末。

芦丁标准品（纯度 98%）、槲皮素标准品（纯度99.7%），成都曼斯特生物科技有限公司。

无水乙醇，郑州派尼化学试剂厂；石油醚（沸程30～60 ℃），国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-吡啶并肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），日本东京化成工业株式会社；乙腈（色谱级），美国TEDIA试剂有限公司；甲酸（色谱级），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AUY220电子天平，日本岛津公司；KQ250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；BJ-100高速多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；RE-2000B旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限公司；SH-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；FD-1B真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪（配有UV-VIS检测器，UV-VIS的型号为Agilent 1100/1200 VWD），美国Agilent公司；UPLC- Orbitrap fusion色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源(ESI)及离子阱质量分析器（orbitrap）)，美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 苎麻籽乙醇提取物和样品液的制备

根据文献[15，16]，采用70%的乙醇溶液（V/V）提取苎麻籽中的化学成分。取一定量苎麻籽粉末，按照液料比20:1（mL/g）加入70%的乙醇溶液（V/V），在功率250 W、温度60 ℃的超声清洗器中超声提取90 min后抽滤。滤液在 50 ℃下减压蒸发，回收乙醇，获得浓缩液。浓缩液经石油醚多次萃取，除去脂溶性物质，再减压蒸发除去石油醚，在-70 ℃下冷冻干燥得苎麻籽乙醇提取物。适量称取获得的苎麻籽乙醇提取物固体，以 70%乙醇溶液（V/V）为溶剂，适量溶剂使之溶解，获得样品液。

1.3.2 对照品溶液配置

精密称取芦丁和槲皮素标准品各20.0 mg，以70%乙醇溶液（V/V）为溶剂，配制成浓度均为0.2 mg/mL的对照品溶液。

1.3.3 DPPH溶液配置

精密称取25 mg DPPH，以无水乙醇为溶剂，使用25 mL的容量瓶定容至 25 mL，配置成浓度为1 mg/mL DPPH溶液。

1.3.4 苎麻籽乙醇提取物的抗氧化组分分析

采用DPPH-HPLC法，分析苎麻籽乙醇提取物中，是否存在抗氧化组分。取 0.2 mL样品液与 1 mL 1 mg/mL DPPH溶液混合，避光放置30 min，经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC分析，以1 mL无水乙醇代替DPPH溶液为反应前对照。

HPLC条件：Agilent 5TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；在线脱气单元、四元泵、UV检测器、手动进样器；柱温30 ℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm[17]，进样量10 μL，样品液经0.45 μm滤膜过滤。梯度洗脱条件[18]如表1。

表1 HPLC梯度洗脱条件Table 1 HPLC gradient elution conditions

1.3.5 苎麻籽乙醇提取物的 UPLC-Orbitrap-HRMS分析

采用 UPLC-Orbitrap-HRMS，对苎麻籽乙醇提取物进行成分分析。

UPLC条件：Agilent 5TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、在线脱气单元、四元泵、自动进样器，柱温40 ℃，流速0.5 mL/min，样品液滤膜过滤后进样5 μL，梯度洗脱条件见表1。

HRMS条件：电喷雾离子源（ESI），离子阱质量分析器（orbitrap），喷雾电压3500 V（正离子模式），毛细管温度320 ℃，鞘气40 Arb，辅助气5 Arb。

2 结果与讨论

2.1 苎麻籽乙醇提取物的DPPH-HPLC及各色谱峰的紫外分析

DPPH是一种较为稳定的小分子自由基，常用于天然产物中抗氧化剂的筛选[19]。抗氧化活性成分与DPPH中的单电子进行配对，使得抗氧化物质结构发生变化，在HPLC谱图上表现为抗氧化物质峰面积的减少或消失。因此比较样品与 DPPH反应前后的HPLC谱图，可以初步判断样品中是否含有抗氧化活性组分[20]。图1为苎麻籽乙醇提取物与DPPH反应前后的HPLC谱图。从图1可以明显看出，苎麻籽乙醇提取物中出现13个峰。当苎麻籽乙醇提取物与DPPH反应后，其中峰1、2、3、4、6的色谱峰峰面积明显减小，峰9的色谱峰已消失，表明苎麻籽提取物中有多种抗氧化活性物质。

黄酮类化合物的紫外吸收主要分布在 300～400 nm（带Ⅰ）和220～280 nm（带Ⅱ）两个波段[21]。为了进一步分析上述色谱所分离出的物质（1、2、3、4、6、9）是否属于黄酮类化合物；应用Agilent 1100高相液相色谱仪，采用在线停泵扫描方式，扫描上述各种物质的紫外吸收光谱。停泵时间为目标色谱峰的出峰到峰顶保留时间的三分之一，扫描波长范围为190～400 nm。结果如表2所示。从表2中可以看出，色谱峰1只在带Ⅱ中存在紫外吸收，但是色谱峰2、3、4、6、9在带Ⅰ和带Ⅱ中都存在紫外吸收，且带Ⅰ中的最大紫外吸收波长分别为：347、350、245、352、291 nm，带Ⅱ中的最大紫外吸收波长分别为：258、260、259、260、242 nm。在两个吸收带中都存在紫外吸收的色谱峰2、3、4、6均符合黄酮类物质的紫外吸收特征，因此推断苎麻籽乙醇提取物含有多种抗氧化活性的黄酮类化合物。

表2 各色谱峰的紫外吸收带Table 2 Ultraviolet absorption bands of various peaks

2.2 UPLC-Orbitrap-HRMS分析

为进一步明确苎麻籽乙醇提取物中的化合物，采用UPLC-Orbitrap-HRMS对其进行分析。图2为样品的总离子流色谱图，将其与对照品质谱数据、MsBank、mzCloud质谱数据库以及相关文献进行对比，初步鉴别出20种化合物（见表3），其中黄酮类化合物10种，分别为原花青素二聚体、芦丁、异槲皮苷/金丝桃苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷/山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮苷、槲皮素、山萘酚、阿福豆苷。B族维生素3种，分别为维生素B1、维生素B6、维生素B2。核苷类物质2种（鸟苷和腺苷），氨基酸类物质 2 种（N6，N6，N6-三甲基-L-赖氨酸和酪氨酸），糖类物质2种（麦芽四糖和D-氨基葡萄糖），酸类物质1种（反式-3-吲哚丙烯酸）。

表3 质谱分析结果Table 3 Mass spectrometry results

目前对于苎麻中化学成分的研究报道很多，但仅限于苎麻的根茎叶。研究人员发现，苎麻根含有酚类、多糖类、黄酮、萜类及有机酸类物质，并且从根据其紫外吸收光谱，可初步鉴定出苎麻根中含有黄酮类化合物，同时发现起抗氧化作用的是其中的黄酮苷元[22]。苎麻叶中含有与根中所含的相同成分绿原酸，此外还含有原儿茶酸等有机酸和黄酮类化合物野漆树昔，芦丁等。鲜叶中还含α-及β-胡萝卜素、叶黄素和含量较高的维生素A[13]。将苎麻根和苎麻叶中所含的化合物与本实验鉴定出来的化合物进行对比，可以发现苎麻籽其中原花青素二聚体、芦丁、异槲皮苷/金丝桃苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷/山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮苷、槲皮素、山萘酚、阿福豆苷都是属于黄酮苷元，与苎麻叶和苎麻根中的黄酮类化合物基本一致，并且具有较强的抗氧化活性。

2.3 黄酮类化合物的结构及其质谱裂解途径分析

从提取物中鉴定出来的20种化合物中，黄酮类化合物占绝大部分，进一步表明黄酮类化合物可能是苎麻籽中的主要抗氧化成分。根据初步鉴定的各黄酮类化合物的结构，分析其可能的质谱裂解途径。

2.3.1 化合物9

化合物9准分子离子峰[M+H]+的质荷比为m/z579，推测分子质量为 578，其二级质谱（图3）中观察到关键碎片离子m/z409和m/z291，这与原花青素二聚体的裂解规律一致。有研究表明，原花青素二聚体的裂解方式主要包括黄烷醇之间连接键的断裂和逆迪尔斯-阿德尔反应（Retro-diels-alder，RDA）[28]。RDA反应是失去了一个中性结构C8H8O3后再失去一个H2O后产生碎片离子m/z409；黄烷醇间的连接键发生断裂产生碎片离子m/z291，即[（表）儿茶素+H]+。[（表）儿茶素+H]+可以进一步发生RDA裂解，C环1，4键（1，4 A）断裂后产生包含A环但失去B环的碎片离子m/z127；C环的1，3键（1，3 A）断裂后产生包含A环丢失B环的碎片离子m/z139以及C环的1，2键（1，2 A）断裂后产生碎片m/z167[37]。由此推测化合物9为原花青素二聚体，分子式为C30H26O12，其可能的裂解途径为图4。

2.3.2 化合物12

化合物12的质谱信息与芦丁对照品一致，确定为芦丁，分子式为C27H30O16，其MS图为图5。准分子离子峰[M+H]+、[M+Na]+的质荷比分别为m/z611和m/z633，碎片离子m/z303为其脱去芸香糖（C12H20O9）后的[槲皮素+H]+。在一级质谱图中观察到碎片离子m/z465，推测为准分子离子[M+H]+经碰撞失去一分子的鼠李糖形成的[M+H-C6H10O4]+[29]。由此，推导出芦丁可能的裂解途径如图6所示。

2.3.3 化合物13、15、17

化合物13、15、17的二级质谱均为m/z303的碎片离子，推测为[槲皮素+H]+。化合物 13的准分子离子[M+H]+质荷比为m/z465，推测其分子质量为464，在碰撞过程中失去一个分子质量为162的葡萄糖或半乳糖中性片段[30]，其可能为异槲皮苷或金丝桃苷；化合物 15的准分子离子峰[M+H]+质荷比为m/z435，推测其分子质量为 434，在碰撞过程中失去了一个分子质量为 132的中性片段[38]，化合物 15可能为槲皮素-3-O-β-D-木糖苷；化合物17的准分子离子峰[M+H]+质荷比为m/z449，推测分子质量为448[33]，推测其为槲皮苷。化合物13、15、17可能的结构和裂解途径如图7所示。

2.3.4 化合物18

化合物18的质谱信息同槲皮素对照品一致，推测为槲皮素，分子式为C15H10O7，准分子离子峰[M+H]+的质荷比为m/z303，其二级质谱如图8所示。苯环较稳定，黄酮醇的裂解多为C环发生的RDA反应，槲皮素的 C 环0，2 键（0，2 A）与 1，3 键（1，3 A）发生断裂，分别生成包含A环但失去B环的碎片离子m/z165和m/z153[34]。此外在裂解中，羰基由于其较强的电负性较容易失去[34]，所以推测槲皮素在失去了一个C环上的羰基（CO）后得到碎片离子m/z275，该碎片再失去一分子H2O得m/z257，或者槲皮素先丢失一个H2O得m/z285再失去一个CO得m/z257。碎片离子m/z257经重排后再失去一个CO得m/z229[39]。图9为化合物18可能的分裂途径。

2.3.5 化合物19

化合物19的准分子离子峰[M+H]+的质荷比为m/z287，二级质谱（图10）中出现与槲皮素质谱中部分相同碎片离子峰m/z153和m/z165，猜测化合物19与槲皮素具有类似的结构，且其准分子离子峰[M+H]+的质荷比以及部分二级碎片离子的质荷比均比槲皮素少16（如m/z287与m/z303、m/z213与m/z229、m/z241与m/z257、m/z259与m/z275、m/z269与m/z285），即一个O原子的相对质量，从而推测化合物19的分子式为C15H10O6，从而推测可能是与槲皮素裂解相似的山萘酚[35]。山萘酚的C环0，2键（0，4 A）与C环1，3键（1，3 A）发生断裂，分别生成包含A环但失去B环的碎片离子m/z165和m/z153。此外，山萘酚在失去了一个C环上的羰基（CO）后得到碎片离子m/z259，该碎片再失去一分子H2O得m/z241，或者山萘酚先丢失一个H2O得m/z269再失去C环羰基得m/z241。碎片离子m/z259与m/z241可再失去一分子CO分别得到m/z231和m/z213。图11为化合物19可能的分裂途径。

2.3.6 化合物14、16、20

化合物14、16、20的二级质谱均为m/z287碎片离子，推测为[山萘酚+H]+。化合物 14准分子离子[M+H]+质荷比为m/z595，推测其分子质量为594，与芦丁的裂解相似，在二级质谱中失去了一个相对质量为308的分子片段[31]，推测其为山萘酚-3-O-β-D-芸香糖苷。化合物 16的准分子离子[M+H]+质荷比为m/z449，推测其分子质量为448，二级质谱中失去一个分子质量为162的分子片段，猜测该片段为葡萄糖或半乳糖[32]，其可能为山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷。化合物20的准分子离子[M+H]+质荷比为m/z433，推测其在二级质谱中失去一分子鼠李糖[36]，可能为为山萘酚-3-O-β-D-鼠李糖苷，即阿福豆苷。图12为化合物14、16、20可能的化学结构及裂解途径。

2.3.7 非黄酮类化合物

除黄酮类化合物外，还从苎麻籽提取物中鉴定出糖类、核苷类、氨基酸类和B族维生素等化合物。化合物2准分子离子峰[M+Na]+的质荷比为m/z689，其二级碎片与文献[23]中麦芽四糖的质谱数据一致，推测化合物2为麦芽四糖，推测其相对分子质量为666。参考文献[24]，推测出化合物4和7分别为鸟苷和腺苷，二级碎片中的m/z152与m/z136分别为二者脱去一分子核糖后所得。化合物5与文献[37]中酪氨酸的质谱信息一致，推测其为酪氨酸。化合物6、8、11分别与文献[26，27]中所描述的维生素 B1、维生素 B6、维生素 B2的质谱数据一致，推测化合物6为维生素B1，化合物8为维生素B6，化合物11为维生素B2。

3 结论

本研究首先基于DPPH-HPLC技术，发现苎麻籽乙醇提取物存在多种抗氧化成分。应用 UPLC-Orbitrap-HRMS技术，对其主要化学成分进行分析。结合 MsBank、mzCloud质谱数据库，相关文献和相关对照品对样品主要化学成分质谱图进行分析。初步鉴定苎麻籽乙醇提取物含有黄酮类化合物10种，分别为原花青素二聚体、芦丁、异槲皮苷/金丝桃苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷/山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮苷、槲皮素、山萘酚、阿福豆苷。其他物质为维生素B1、维生素 B6、维生素 B2、鸟苷、腺苷、N6，N6，N6-三甲基-L-赖氨酸、酪氨酸、麦芽四糖、D-氨基葡萄糖和反式-3-吲哚丙烯酸。苎麻籽乙醇提取物中主要是黄酮类化合物，上述黄酮类化合物是已被证明过有较强抗氧化活性的黄酮糖苷类，说明苎麻籽具有潜在的抗氧化活性，这为后续苎麻籽的开发和利用提供了良好的理论基础。