金柚幼果黄酮对AAPH诱导红细胞氧化损伤的保护作用

纳雨农 ，陈乃驿 ，张涣悠 ，王琴 ，2，3，肖更生 ，3，刘袆帆 ，2，3*

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510550）（2.仲恺广梅研究院，广东 梅州 514799）（3.广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，广东 广州 510550）

柚子是我国广泛种植的水果品种之一，广东特色品种金柚已成为国家优势特色产业[1]。未成熟的柚子在生长期自然脱落以及果农进行疏花疏果产生的落果称为金柚幼果[2]。金柚幼果的研究主要包括膳食纤维、多糖、柚皮苷、活性肽等，本课题组在前期研究中提取了金柚幼果的膳食纤维[2]和多糖[3]，其中总膳食纤维含量为75.63%，在四氧嘧啶诱导小鼠高血糖模型中有效降低小鼠血糖水平，通过调节肠道菌群丰度缓解糖尿病症状；发现金柚幼果多糖表面为光滑的多孔网状结构，借由小鼠RAW264.7巨噬细胞模型验证多糖的免疫活性。另外，采用响应面法优化后柚皮苷得率为3.8%，发现柚皮苷提取物能有效保护红细胞免受AAPH自由基的攻击，显著降低红细胞溶血率[4]。除了柚皮和幼果，该课题组还通过共发酵体系提高了柚子核活性肽的含量，在抑菌测试中共孵育柚核多肽，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为12.50 μg/mL，其抑菌机理与细菌细胞膜形成孔洞有关[5]。金柚幼果中果瓤占比43%～48%，而柚子果实中黄酮主要存在于果瓤中且在未成熟期累积，故幼果中黄酮含量较高[6-8]。在前期的研究中，罗洁莹等[6]使用微波超声辅助法提取并经过相应面优化，总黄酮的提取率达68.57%。经AB-8大孔树脂纯化后，金柚幼果黄酮类化合物（CF）能显著抑制AAPH诱导红细胞溶血，并呈现明显的剂量依赖性[9]。

AAPH氧化诱导剂常用于红细胞氧化溶血模型中，在水溶液中经热分解会形成相对稳定的过氧自由基，并且会引发自由基链式反应，产生更多种类的自由基[10，11]。以抗氧化活性为跟踪指标，构建红细胞氧化模型，测定过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的酶活性以及丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）的含量，描述模型中酶促抗氧化通路以及非酶促抗氧化通路的变化情况，以此判断物质抗氧化活性[10]。张艳梅等[12]建立 H2O2红细胞溶血模型并发现沙葱总黄酮浓度在30～520 μg/mL时均能够抑制H2O2氧化损伤引起的红细胞溶血，降低红细胞中MDA含量，提高红细胞中GSH-Px、SOD、CAT活性，且呈剂量效应性关系。苏健裕等[13]发现杨梅酮处理会导致 ROS和 MDA含量的降低以及 SOD和GSH-Px的酶活性的增加，且具有一定的剂量依赖性。说明杨梅酮对红细胞的保护主要是通过增强 SOD和GSH-Px酶活性来清除过多ROS。在前期的研究中，发现CF能直接清除自由基，控制自由基引起的氧化损伤，使酶促抗氧化与非酶促抗氧化保持平衡，从而抑制AAPH引起的红细胞溶血[9]。

本研究通过制备液相色谱仪进一步纯化CF得到含量最高的组分 PF，并使用高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS/MS）联用技术[14-16]鉴定PF的化学成分；构建红细胞抗氧化模型评价体系，探讨 PF的抗氧化活性及其机理，本研究为金柚幼果黄酮开发利用提供数据支持；为柚子副产物综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金柚幼果采自广东省梅州市五华县金柚种植园。分析纯级无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂；甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯，购买于美国天地公司；2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）购自上海瑞永生物科技有限公司；PBS磷酸缓冲液（pH=7.2）购自北京雷根生物技术有限公司；6% O型红细胞，抗氧化指标检测试剂盒（LDH、MDA、SOD、GSH-Px、CAT、GSH）均购买于南京建成生物工程研究所。

1.2 设备

XO-SM 超声波-微波协同反应系统，南京西安欧仪器制造有限公司；PHS-25数显pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FA1204B分析天平，上海精科天美科学仪器有限公司；SC-3610低速离心机，安徽中佳科学仪器有限公司；Waters I class液相色谱串联Q-Tof质谱，美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金柚幼果黄酮的分离与纯化

金柚幼果切碎后，在-40 ℃真空冷冻干燥后磨碎成粉并经过60目筛网，得到的金柚粉避光存放于干燥器中。根据王琴[6]的方法提取金柚幼果粗黄酮：使用60%乙醇作为溶剂进行超声-微波协同提取，提取过程中温度控制在60±2 ℃以内，提取完成后以4000 r/min进行离心，时间为10 min，得上清液。将黄酮水提上清液缓慢加入AB-8大孔树脂柱，避光吸附4 h，洗脱水溶性杂质后用40%乙醇水溶液进行洗脱并收集后，真空浓缩，冷冻干燥得粗黄酮CF。

1.3.2 制备型高效液相色谱制备分离黄酮类化合物PF

将CF充分溶解后上样于制备液相色谱柱，制备色谱柱为美国沃特斯 Symmetry Prep C18柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；流动相为0.1%甲酸水-乙腈，线性梯度洗脱程序如表1所示；流速为1.0 mL/min。流动相在使用前需经0.45 μm微孔滤膜抽滤，超声脱气；进样量为400 μL；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm。收集峰面积最大的组分，真空浓缩冷冻干燥后得金柚幼果黄酮（PF）。

表1 制备液相梯度洗脱程序Table 1 Preparation of liquid phase gradient eluting procedure

1.3.3 ESI-LC-MS/MS分析

液相色谱条件如下Waters Cortecs C18色谱柱（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脱程序如表2所示；流速为 0.3 mL/min，进样量20 μL；柱温40 ℃。

表2 ESl-LC-MS/MS液相梯度洗脱程序Table 2 Gradient eluting procedure of ESI-LC-MS/MS

质谱条件如下，离子方式：EIS+；毛细管电压：2.98 kV；锥孔电压：25 V；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；质量范围：50～1200m/z；分析仪真空度：3.25e-7 mBar；锥孔气体流量：49 L/h；脱溶剂气体流量：790 L/h。

1.3.4 PF对红细胞氧化损伤的保护作用

1.3.4.1 红细胞氧化损伤模型的建立

参考刘袆帆等[17]的方法，使用PBS溶解PF后分别配成浓度为600、700、800、900、1000 μg/mL的待测液。红细胞悬液在4 ℃下以3000 r/min离心5 min去除上清液，再加入适量PBS溶液后离心，此步骤重复三次后将红细胞配成体积比为 6%的红细胞悬液。取0.2 mL红细胞悬液并加入200 μL待测液，AAPH组加入等体积 AAPH溶液，空白对照组加入等体积PBS溶液，与红细胞充分混匀，37 ℃下避光缓和震荡孵育30 min后，加入AAPH溶液，混匀，相同条件下孵育2.5 h后测定实验结果。实验设计三次平行取平均。

1.3.4.2 红细胞溶血率的计算

将孵育结束后的反应液在 4 ℃条件下以 3000 r/min离心10 min，上清液使用酶标仪测定540 nm处吸光值A。取相同浓度的红细胞悬液加入等体积的水进行裂解，同样在540 nm处测得吸光值B。

1.3.4.3 红细胞氧化损伤实验

将孵育结束后的红细胞用PBS洗涤2～3次，加入4倍体积超纯水裂解细胞，冰浴后于4 ℃、3000 r/min离心5 min，上清液保存于-40 ℃冰箱备用。采用未稀释的裂解液按照试剂盒的操作方法测定 GSH-Px和LDH，测定GSH-Px和LDH的酶活。GSH的含量测定时，用超纯水将裂解液稀释5倍，具体操作按照试剂盒的指示进行。将裂解液稀释20倍后，按照试剂盒的方法测定MDA的含量。将裂解液稀释80倍，按照试剂盒表明的方法测定 SOD的酶活。以上所有实验重复3次。

1.4 数据处理

使用SPSS 25.0对实验数据进行单因素方差分析，结果表示为平均值±标准差（mean±SD），以Duncan多边检验对实验均值进行差异显著分析（p＜0.05）。用Origin 2018对分析数据作图。

2 结果与讨论

表3 PF化学成分鉴定表Table 3 Table of chemical constituents from young fruit extract of golden pomelo

2.1 金柚幼果黄酮PF的制备及化合物种类分析

如图所示，经梯度洗脱后的CF共有6个明显的尖峰。其中，19.852～20.942 min的峰面积为27532.896，标记为峰A。收集峰A，冻干后得到PF。

PF经LC-MS分析后发现共有33种物质，含量最高为12-甲基十四酸甲酯，经鉴定比对，PF中含有8种有机酸、3种有机酸酯、7种生物碱以及2种黄酮类物质。详细结果如表2所示。物质相对含量如图2a所示，PF中有机酸及有机酸酯相对含量最高；黄酮类化合物占PF物质含量的28.19%，两种黄酮类化合物分别为四羟基查尔酮及美鼠李苷，相对含量分别为15.57%、12.62%。

四羟基查尔酮是PF中含量最高的黄酮类化合物，其相对含量为15.57%。如图3a所示，其化合物分子结构独特，含有多个反应中心，可以与多种受体结合，从而表现出广泛的生物活性，可以作为有机合成及药物合成中间体[28]，天然产物提取的查尔酮类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等作用[19，29]。Zhong等[30]使用四羟基查尔酮作为中间体合成出的查尔酮类抗白癜风药物表现出较高的黑素生成能力、抗氧化活性及较低的毒性。美鼠李苷是一种黄酮甙类化合物，具有一定的抗氧化活性[20，31]。黄酮甙类物质具有良好的DDPH自由基清除能力，且能够抑制α-糖苷酶的活性影响糖代谢，从而对糖尿病小鼠血糖指标有改善作用[32-34]。

2-O-咖啡酰基熊果苷是一种多酚类物质，最初发现于杜鹃花科熊果属小灌木植物中[35]，其 DPPH自由基清除率效果略差于Vc[21]。熊果苷能治疗由紫外线诱导的各种皮肤色素作用，控制羟基自由基的产生熊果苷是酪氨酸酶抑制剂。它阻断多巴及多巴醌的合成，从而抑制黑素的生成[36]，在护肤用品和发用制品方面有广泛的用途[37]。水苏碱和甜菜碱为生物碱，具有抗菌消炎的作用[38-40]。水苏碱是益母草抗栓、抗凝、降脂的主要有效成分[25]，已有相关报道表明其对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用[41，42]，对CCl4所致小鼠肝损伤的保护作用[43，44]。水苏碱主要通过抑制炎症因子的表达和氧化应激以及调节MMPs/TIMPs系统来抵抗肝纤维化。水苏碱有望成为治疗肝纤维化的候选药物[45]。甜菜碱可以保护细胞在高渗透条件下免受损伤。甜菜碱并不能直接清除AAPH自由基，却可以使机体抗氧化酶活力恢复至正常水平，从而提高植物在逆境中的抵抗能力[11]。Zhang等[24]的研究发现甜菜碱能通过蛋氨酸-同型半胱氨酸循环提高腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的水平，提高系统清除活性氧簇的能力。PF具有多种活性物质，故推测其具有较好的抗氧化活性，为下一步PF的红细胞抗氧化模型评价奠定基础。

2.2 PF的红细胞抗氧化模型评价

通过PF对AAPH诱导红细胞溶血模型的保护作用研究发现，不同浓度PF下对AAPH诱导的红细胞溶血保护效果表现出剂量反应，如图4所示。在相同的孵育条件下，阴性组添加PBS而不经AAPH处理，自然产生的溶血率为20.83%，而AAPH组的溶血率为52.79%，显著高于经PF处理后的实验组（p＜0.01）。当PF的含量为1000 μg/mL时，溶血率为31.63%与900 μg/mL的实验组无显著差异。在陈华敏等[46]的研究中，使用AB-8大孔树脂纯化高粱糠多酚提取物并得到五种类型酚，其中游离酚、束缚型酚和可溶性酯型酚浓度达到 200 μg/mL时，红细胞溶血率已降至10%与空白组无显著性差异而可溶性苷型酚的溶血率仍为28.84%，其中可溶性苷型酚和束缚型苷型酚的抗溶血活性相对较弱，黄酮与苷酚结构相似，酯型酚类化合物抗溶血活性更高。

2.2.1 PF对非酶促抗氧化体系的影响

在红细胞氧化溶血模型中，自由基攻击细胞会造成脂质过氧化反应的产生，丙二醛（MDA）则是脂质过氧化反应中的副产物之一，MDA的含量被用作胁迫反应过程的生物标志[10，47，48]。各组 MDA 的含量如图5所示：AAPH组MDA含量显著高于阴性组，在经过1000 μg/mL的PF处理后，MDA的含量为27.39 nmol/mg与阴性组25.01 nmol/mg无显著差异且在不同浓度实验组之间表现出剂量反应。

乳酸脱氢酶（LDH）参与丙酮酸的代谢，该酶的酶活性与细胞内释放到细胞外的量有关进而可用于表示细胞的受损程度。如图6所示，LDH的酶活随PF的浓度升高而降低，AAPH组LDH酶活为470.85 U/L，明显高于实验组。当PF浓度为1000 μg/mL时的LDH的酶活为314.85 U/L，显著高于浓度为600 μg/mL的实验组，而与AAPH组有显著差异，当PF浓度为1000 μg/mL时，LDH的释放量显著高于阴性组。

GSH广泛存在于细胞中，既能维持正常的免疫系统功能，同时参与非酶促抗氧化体系，可以在GSH-Px的催化下与GSSG相互转化从而应对氧化应激[10，49]。GSH的含量水平可以表征自由基对细胞氧化胁迫反应的程度。图7可知，AAPH组GSH含量为258.40 μmol/L，显著低于经过 PF处理的实验组，且实验组在不同浓度下存在一定的剂量反应，其中 PF含量大于900 μg/mL时，可以较好维持细胞内GSH含量。

PF浓度为1000 μg/mL可以阻止细胞膜脂质的过氧化反应，缓解非酶促抗氧化体系的氧化应激；在AAPH诱发的氧化应激下，细胞膜的完整性随着 PF浓度的变化受到不同程度的保护，PF浓度为 1000 μg/mL细胞膜仍受到损伤，但其保护作用表现出与AAPH对照组显著的差异，同时GSH的含量随PF浓度上升而提高，说明 PF具有一定的清除自由基的作用。MDA的含量下降，LDH的释放降低，说明细胞膜完整性上升，PF对细胞膜具有保护作用，在王荣等[50]设计的AAPH诱导红细胞溶血模型中，亚麻木酚素表现出相似的作用机理，在林恋竹等人[51]的研究中，在250、625、1250 μg/mL三个浓度下处理的红细胞溶血率、SOD酶活、MDA含量并未表现出明显剂量反应，与多酚黄酮的作用机理不同。

2.2.2 PF对酶促与抗氧化体系的影响

在红细胞清除自由基的过程中，SOD是最先发挥作用的抗氧化酶之一，SOD能催化超氧阴离子发生歧化反应，生成毒性相对较低H2O2，再经过GSH-Px酶和CAT酶的催化后分解[10，11，49]。由图8可知，经PF处理后的实验组 SOD酶活均与阴性组无显著差异，酶活均小于 241.04 U/L；AAPH组中 SOD酶活为1146.21 U/L，差异明显（p＜0.01），无剂量反应，说明在AAPH诱导红细胞氧化系统中，经PF处理的实验组红细胞的自由基平衡不通过酶促抗氧化体系完成。

AAPH自由基诱导剂在水溶液中经热分解会形成相对稳定的过氧自由基，并且会引发自由基链式反应，H2O2也是其中的子产物之一[11]。由图9可知经AAPH处理的实验组 CAT酶活显著高于阴性组 CAT酶活（16.99 U/L），而低于AAPH组CAT酶活（198.55 U/L），说明AAPH诱导红细胞氧化的模型中参与过氧化氢分解而导致活性上升。CAT酶活性的测试与SOD酶活实验组相似，并未表现出剂量反应。

由图10可知，在AAPH的刺激下，红细胞内的GSH-Px活性被激发，AAPH组的酶活显著高于实验组以及阴性组，当PF浓度为1000 μg/mL时，GSH-Px酶活显著低于其余实验组且高于未经AAPH处理的阴性组。GSH-Px参与红细胞内的酶促抗氧化体系[52]，同时参与催化GSH与GSSG的相互转化。结合SOD酶活和 CAT酶活的结果，酶促抗氧化体系并不是此模型中应对氧化应激的主要通路，所以主要是 GSH与GSSG的相互转化使得GSH-Px的需求量增加。

综上所述，经PF处理的实验组在AAPH诱导红细胞氧化模型中可以起到抑制红细胞溶血的作用。1000 μg/mL时MDA含量为27.39 nmol/mL与阴性组25.01 nmol/mL无明显差异，LDH酶活为314.75 U/L高于阴性组144.96 U/L，说明在模型中，细胞膜受到影响，PF可以起到保护细胞膜的作用。SOD酶活在不同浓度PF处理后未产生剂量反应，说明细胞超氧阴离子并非经SOD分解。细胞内H2O2含量增加导致CAT酶活增加；GSH含量降低而导致GSH-Px酶活增加，说明细胞内自由基主要经过非酶促抗氧化体系清除。

综合上述指标，红细胞溶血率降低，完整性得到保护。其内在原因是PF缓解了AAPH诱导的氧化应激，GSH含量高于AAPH组，SOD酶活性与对照组无明显差异说明 PF能直接清除自由基，并以此缓解自由基引起的氧化损伤。PF中美鼠李苷和2-O-咖啡酰基熊果苷为抗氧化活性物质，具有清除自由基的能力，在AAPH诱导红细胞氧化溶血的模型中，推测可以缓解 GSH为主的非酶促抗氧化体系氧化应激，减少氧化应激自由基的产生。水苏碱与甜菜碱两种生物碱在PF中的含量较低，推测在模型中起到提升酶促体系中GSH-Px酶活的作用，从而缓解氧化应激。

3 结论

本研究以金柚幼果为对象，采用制备液相收集黄酮类物质PF，并使用ESI-LC-MS在PF中鉴定多种活性物质。通过构建AAPH诱导红细胞氧化溶血模型，研究了实验组不同浓度PF处理后溶血抑制率的变化，测定了细胞内抗氧化体系中的关键指标，从而推断PF的抗氧化作用机理。PF具有一定的自由基清除能力，可以缓解AAPH诱导的红细胞氧化应激，且主要通过非酶促抗氧化体系清除自由基。黄酮提取物中具有抗氧化活性的主要成分为美鼠李苷和 2-O-咖啡酰基熊果苷。该研究为金柚幼果中抗氧化性物质综合利用提供新思路，为天然产物开发与应用提供理论依据。