甜菜碱提高LO2细胞中抗氧化酶的表达水平

2022-03-07张猛猛辛璇赖富饶吴晖

现代食品科技 2022年2期

张猛猛，辛璇，赖富饶，吴晖

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

甜菜碱（BET）是一种广泛存在于动植物和微生物中的季胺碱类物质，其可作为甲基供体参与蛋氨酸循环，也可作为渗透调节剂调节细胞渗透压，目前被广泛应用于食品添加剂、制药、饲料、日化等领域。由于合成甜菜碱的能力有限，人类需要通过食用富含甜菜碱的食物（如谷物、菠菜等）获取甜菜碱[1]。一般来说日常饮食摄入的甜菜碱即可满足身体所需，但有研究发现额外补充甜菜碱能够预防和辅助治疗多种疾病，尤其是对由疾病、药物、酒精等多种因素引起的肝损伤有一定的保护作用[2]。其中的机制主要和甜菜碱的抗氧化能力密切相关[3，4]。与常见天然抗氧化剂不同的是，甜菜碱并无直接的自由基清除能力，其主要通过增强机体自身的抗氧化能力来发挥抗氧化功能[5]。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）等组成的抗氧化酶系统是机体抗氧化防御体系的重要组成部分。已有很多文献报道甜菜碱能够提高机体内SOD、GPx、CAT等抗氧化酶的酶活和表达水平[6，7]，但其中的机制尚不清楚。事实上，甜菜碱因卓越的抗氧化能力，在水果保鲜、畜牧养殖等领域也展现出巨大的应用价值。随着甜菜碱的应用潜力和研究价值越来越被人们所关注，解析甜菜碱增强抗氧化酶表达的机制，不仅能够深化对甜菜碱保护肝脏等功能的认识，还能为甜菜碱进一步的研究与应用奠定理论基础。

细胞抵御氧化应激的主要通路是转录因子NF-E2相关因子 2(Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-抗氧化反应元件（ARE）通路。该通路能够调控抗氧化酶系及Ⅱ相解毒酶的表达，以清除过多的活性氧（ROS）造成的氧化应激。近些年来，该通路还被发现可作为药物靶点，应用于由氧化应激诱导产生的疾病的预防和治疗中[8]。笔者在前期的研究中发现，甜菜碱能够提高处于正常状态下的人体肝细胞LO2细胞中SOD、CAT等抗氧化酶的酶活[7]，但还不清楚Nrf2-Keap1-ARE通路在其中的作用。本研究拟通过探究甜菜碱对 LO2细胞抗氧化酶表达水平的影响，及该影响与 Nrf2-Keap1-ARE通路的关系，来揭示甜菜碱提高抗氧化酶表达水平的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜菜碱（98%纯度）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂购自南京建成生物工程研究所；细胞核蛋白质提取试剂盒、UNIQ-10柱式总 RNA抽提试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒、2×SG Fast qPCR Master Mix试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；人转录因子 NF-E2相关因子 2(Nrf2) ELISA试剂盒购自Thermo Fisher公司；Nrf2、pNrf2、Keap1以及β-actin等蛋白的抗体购自Abcam公司；PD98059、LY294002、SP600125、SB203580、GF109203X、Compound C购自MCE (MedChemExpress)公司；LO2细胞系，本实验室保存；DMEM培养基、胰酶购自GIBCO公司；胎牛血清购自Hyclone公司。

1.2 主要仪器设备

ABI 7500实时荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Infinite M1000 Pro酶标仪，瑞士Tecan公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞毒性

取对数生长期的LO2细胞，以1×104cells/孔的数量接种于96孔板，用DMEM培养液（1%双抗、10%胎牛血清）在5% CO2，37 ℃条件的培养箱中培养24 h。去除上清液，加入100 μL含不同浓度甜菜碱的新鲜培养液（62.5、125、250、500、1000 μmol/L），以正常培养液作为阴性对照。12 h后弃去含药培养液，加入100 μL含10% CCK8试剂的培养液，继续培养1 h后于450 nm处测每孔的吸光值。细胞存活率按以下公式计算：

细胞存活率/%=As/Ac×100%

式中：

As——样品的吸光值；

Ac——阴性对照的吸光值。

1.3.2 实时荧光定量PCR（QPCR）

将LO2细胞配成浓度为1×105cells/mL的细胞悬液后接种于6孔板，每孔3 mL。培养24 h后吸去培养基，分别加入不同浓度的甜菜碱（62.5、125、250、500、1000 μmol/L）。12 h后，收集并裂解细胞，使用UNIQ-10柱式总 RNA抽提试剂盒提取 LO2细胞总RNA，使用AMV第一链cDNA合成试剂盒将RNA反转录成cDNA，使用2×SG Fast qPCR Master Mix试剂盒进行PCR扩增。以β-actin为内参，结果用2-ΔΔCt表示。SOD、CAT、GPx、Nrf2、Keap1、β-actin等的引物序列见表1。

表1 所用引物序列Table 1 The primer sequence

1.3.3 甜菜碱对 Nrf2-Keap1-ARE通路中相关蛋白水平的影响

将LO2细胞配成浓度为1×105cells/mL的细胞悬液后接种于10 cm培养皿，每皿10 mL。培养24 h后吸去培养基，加入250 μmol/L甜菜碱处理12 h。然后收集细胞，每20 μL细胞沉淀加入200 μL浆蛋白抽提试剂，冰浴孵育10 min，然后4 ℃条件下12000 r/min离心10 min，上清液为细胞浆蛋白，沉淀为细胞核。收集细胞核沉淀，加入50 μL核蛋白抽提试剂，冰浴10 min，然后于4 ℃条件下12000 r/min离心10 min，所得上清液即为细胞核蛋白。用 BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞核蛋白中蛋白质含量，然后利用Nrf2 ELISA试剂盒检测细胞核提取物中可与ARE位点结合的Nrf2蛋白的含量。

细胞核内Nrf2的相对水平=C样品/C对照

式中：

C样品——甜菜碱处理组细胞核内的Nrf2蛋白含量，pg/mg蛋白；

C对照——对照组细胞核内的Nrf2蛋白含量，pg/ mg蛋白。

按上述条件处理细胞，使用 NP40裂解细胞，然后4 ℃条件下12000 r/min离心10 min，收集上清液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞裂解液中蛋白质含量。利用SDS-PAGE分离细胞裂解液中的蛋白，再将蛋白转移到 PVDF膜上。将膜与 Nrf2、pNrf2、Keap1以及β-actin抗体4 ℃孵育过夜，再与二抗室温孵育1 h。最后利用特超敏ECL化学发光试剂检测蛋白条带，利用Image J软件检测蛋白条带灰度值。

蛋白质相对水平=G样品/G对照

式中：

G样品——甜菜碱处理组细胞内的Nrf2与β-actin蛋白条带灰度值之比；

C对照——对照组细胞内的Nrf2与β-actin蛋白条带灰度值之比。

1.3.4 激酶抑制剂对甜菜碱提高抗氧化酶mRNA水平的影响

分别往铺有细胞的6 cm培养皿加入250 μmol/L的甜菜碱和不同激酶抑制剂（1 μmol/L PD98059、1 μmol/L LY294002、1 μmol/L SP600125、1 μmol/L SB203580、 2.5 μmol/L GF109203X 、 1 μmol/L Compound C），以不加抑制剂的甜菜碱处理组为对照，处理12 h后收集细胞，提取RNA，检测Nrf2、Keap1和三种抗氧化酶的mRNA水平。

1.4 数据处理

结果采用平均值±标准偏差（SD）表示，使用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）并进行多组之间均数的差异性检验，p＜0.05时认为有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 甜菜碱对LO2细胞中抗氧化酶表达的影响

如图1所示，在250～1000 μmol/L甜菜碱处理12 h后，细胞内的SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的mRNA水平显著高于对照组（p＜0.05），最高分别提高了1.08、0.51、0.88倍。这与Yu等人[9]在羊羔体内、Elsheikh等人[10]在小鼠体内的研究结果接近，但显著低于 Cai等人[6]在湖羊体内的检测结果。这一结果的差异可能在于不同的研究所使用的模型、检测的组织部位、甜菜碱所用剂量和处理时间不同。此外，在 250～1000 μmol/L的剂量内，SOD、GPx和CAT的mRNA水平并没有随着浓度的增加而提高，这表明甜菜碱对LO2细胞内抗氧化酶表达的提高作用是有限的。

需要指出的是，当细胞或组织处于氧化应激状态时，甜菜碱能否通过提高抗氧化酶的表达来发挥抗氧化功能还存在着一定的争议。其原因是有的研究发现甜菜碱能够提高抗氧化酶的表达，但也有研究表明甜菜碱对抗氧化酶的表达无显著影响，甚至有抑制作用[5]。有研究认为这一现象是甜菜碱通过非酶抗氧化物质调节细胞氧化应激状态的结果：当细胞处于轻度氧化应激状态时，细胞会通过提高抗氧化酶的表达来抵抗氧化应激，而甜菜碱可以通过非酶抗氧化物质抑制氧化应激，从而降低细胞对氧化应激的应答，也就是抗氧化酶表达的提高，这时甜菜碱对抗氧化酶的表达表现出抑制作用；当细胞处于过度氧化应激状态时，细胞会启动凋亡程序，关闭抗氧化酶基因的表达，而甜菜碱通过非酶抗氧化物质缓和氧化应激，阻止过度氧化应激诱导的凋亡程序，从而解除凋亡程序对抗氧化酶表达的抑制，这时甜菜碱对抗氧化酶的表达表现出提高作用[5]。也就是说这些研究认为甜菜碱主要是通过非酶抗氧化系统发挥抗氧化功能，其可能对抗氧化酶的表达并无直接的促进作用[5，11]。这些之前的研究在探究甜菜碱的抗氧化作用时，一般会使用H2O2、对乙酰氨基酚等物质诱导细胞或组织进入氧化应激状态。此时抗氧化酶水平的变化是甜菜碱和这些物质综合作用的结果，并不仅仅是甜菜碱本身对抗氧化酶表达的作用。本研究是以处于正常生理状态的LO2细胞为模型，本研究的结果表明甜菜碱是能够直接刺激细胞提高抗氧化酶的表达水平的。因此，本研究认为，对于处于氧化应激状态的细胞或组织，甜菜碱也可能通过提高抗氧化酶的表达来发挥抗氧化作用，只是最终的抗氧化酶水平是多种因素综合作用的结果。

2.2 甜菜碱对LO2细胞中Nrf2-Keap1-ARE通路的影响

细胞调控抗氧化酶表达的主要通路是 Nrf2-Keap1-ARE通路。在正常生理情况下，Nrf2与胞质内 Keap1蛋白耦联，并锚定于胞质，使其活性处于相对抑制状态，并且Keap1与Nrf2的耦联能促进Nrf2的泛素化降解，从而使细胞内的Nrf2维持在较低水平；当Nrf2从Nrf2-Keap1复合物中脱离，即Nrf2-Keap1-ARE通路被激活时，Nrf2蛋白的泛素化降解被抑制，Nrf2蛋白水平会升高，并由细胞质转移至细胞核，再与ARE结合，从而启动解毒酶和抗氧化酶等基因的表达[12]。因此细胞核内能与ARE结合的Nrf2蛋白水平可以用来表征Nrf2-Keap1-ARE通路是否被激活。为了探究甜菜碱对Nrf2-Keap1-ARE通路的影响，本研究提取了经甜菜碱处理的LO2细胞的细胞核，利用包被有ARE结合位点的ELISA试剂盒检测细胞核内Nrf2蛋白的水平。结果如图2a所示，甜菜碱处理组内能与ARE区域结合的Nrf2的蛋白质水平相比于对照组提高了1.21倍（p＜0.05），这表明甜菜碱能激活Nrf2-Keap1-ARE通路。为进一步验证甜菜碱对Nrf2-Keap1-ARE通路的激活，本研究还探究了细胞内总Nrf2蛋白的水平。结果如图2b所示。经甜菜碱处理的LO2细胞内，Nrf2蛋白质水平显著相对于对照组提高了0.80倍（p＜0.05），这进一步表明了甜菜碱对Nrf2-Keap1-ARE通路的激活作用。鸦胆子苦醇是一种源于苦木科植物鸦胆子种子喹诺酮。由于鸦胆子苦醇能够抑制Nrf2蛋白的表达，并促进Nrf2蛋白的降解，因此常作为Nrf2蛋白的抑制剂被用于研究 Nrf2-Keap1-ARE通路[13]。为了探究Nrf2-Keap1-ARE通路在甜菜碱提高抗氧化酶表达中的作用，本研究探究了鸦胆子苦醇对甜菜碱提高抗氧化酶表达这一作用的影响。结果如图3所示，1 μmol/L的鸦胆子苦醇能完全抑制250 μmol/L甜菜碱对三种抗氧化酶表达的提高作用（p＜0.05）。以上结果表明甜菜碱是通过激活Nrf2-Keap1-ARE通路提高抗氧酶表达的。

一般来说，天然产物激活Nrf2-Keap1-ARE通路主要有以下两种方式，一是提高Nrf2蛋白的表达水平或降低Keap1蛋白的表达水平，Nrf2/Keap1蛋白质水平的比值越高，意味着与Keap1耦联的Nrf2越少，处于活性状态下的Nrf2蛋白越多。二是通过提高Nrf2蛋白的磷酸化水平，或促进Keap1半胱氨酸巯基的化学修饰，促进 Nrf2与 Keap1解离[8，14]。可与 Keap1半胱氨酸上的巯基通过氧化或烷基化形成共价加合物的天然产物大多具有亲电性，这类化合物主要包括具有氧化性的酚和醌类、迈克尔反应受体分子、异硫氰酸酯类、二硫醚和二烯丙基硫化物、含硒化合物等[15]。而甜菜碱并不具属于这几类物质，也不具有亲电性。Nrf2蛋白的磷酸化可由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）等激酶催化，而且这些激酶所涉及的MAPK/ERK、PI3K/Akt等信号通路还能影响Nrf2和Keap1蛋白的表达[16]。有文献报道甜菜碱也可以调节PI3K、MAPK等信号通路[17，18]。因此，甜菜碱提高Nrf2蛋白水平的机制可能有以下几种方式，一是提高Nrf2蛋白的表达水平、二是降低Keap1蛋白的表达水平，三是促进Nrf2蛋白的磷酸化。需要指出的是，由于降低 Keap1蛋白的表达水平和促进Nrf2蛋白的磷酸化可以通过抑制Nrf2蛋白的降解来提高细胞内Nrf2蛋白的水平[12]。因此图2所展示的Nrf2蛋白水平的提高并不意味这Nrf2蛋白表达水平的提高。

2.3 甜菜碱对激活Nrf2-Keap1-ARE通路的机制

为了探究甜菜碱激活 Nrf2-Keap1-ARE通路的机制，本研究探究了甜菜碱对LO2细胞内Nrf2和Keap1的mRNA水平的影响，以及Keap1蛋白质水平和Nrf2蛋白磷酸化水平的影响。结果如图4。从图4可知，甜菜碱并未显著影响Nrf2的mRNA水平（p＞0.05），也就是说甜菜碱可能并不是通过提高Nrf2蛋白的表达水平激活Nrf2-Keap1-ARE通路的。之前也有研究表明甜菜碱不能影响小鼠肝脏中Nrf2蛋白的表达水平[19]。还有，经甜菜碱处理后，Nrf2蛋白的磷酸化水平并未有明显增加，这意味着甜菜碱可能也不是通过提高 Nrf2蛋白的磷酸化水平激活Nrf2-Keap1- ARE通路。由图4可知，经甜菜碱处理后，LO2细胞内Keap1的mRNA和蛋白质水平分别下降了38.21%和49.15%（p＜0.05），这表明甜菜碱可能是通过抑制Keap1的表达水平激活Nrf2-Keap1-ARE通路的。为探究甜菜碱提高Keap1表达水平的机制与PI3K、MAPK等激酶的关系，本研究利用ERK抑制剂PD98059、PI3K/AKT抑制剂LY294002、JNK抑制剂SP600125、p38 MAPK抑制剂SB203580、PKC抑制剂GF109203X、AMPK抑制剂Compound C等抑制剂抑制激酶活性，探究了在这些激酶活性被抑制的调节下，甜菜碱对抗氧化酶和Keap1 mRNA水平的影响。结果如图5，这些抑制剂并未影响甜菜碱对Keap1和抗氧化酶mRNA水平的作用（p＞0.05）。这意味着甜菜碱并不是通过PI3K、MAPK等信号通路影响Keap1的水平的。此外，这些激酶是细胞内蛋白质磷酸化的关键酶，这一结果也从侧面证实甜菜碱对Nrf2-Keap1-ARE通路的激活与Nrf2蛋白的磷酸化无关。

以上结果虽然表明甜菜碱能够降低 Keap1的表达水平，但其中的机制仍不清楚。甜菜碱是机体内一种重要的甲基供体，可显著影响DNA、RNA和蛋白质的甲基化修饰。甜菜碱的很多生理活性，如降脂、抗乙肝病毒等活性都与其甲基供体的角色密切相关[20，21]。甜菜碱对机体非酶抗氧化系统的增强作用也与其作为甲基供体参与蛋氨酸循环有关[5]。常见的甲基供体除甜菜碱外，还有胆碱、蛋氨酸、s-腺苷甲硫氨酸、叶酸等。而这些甲基供体也被报道过能够激活 Nrf2通路，其中叶酸就是通过降低Keap1 mRNA水平激活Nrf2通路的[22-25]。因此，甜菜碱激活Nrf2-Keap1-ARE通路的机制可能与其作为甲基供体的角色有关。DNA启动子的甲基化修饰会显著抑制基因的转录和表达。已有研究报道，提高 Keap1启动子甲基化水平，可以降低 Keap1 mRNA的水平[12]。而甜菜碱可显著影响DNA的甲基化修饰。已有研究报道甜菜碱能显著提高机体某些蛋白DNA启动子的甲基化水平[26]。还有，Keap1 m6A RNA甲基化水平也会影响其Keap1的蛋白质水平[27]。而甜菜碱也报道过能够影响细胞内RNA m6A的甲基化水平[28]。因此，甜菜碱抑制Keap1蛋白水平的机制，一方面可能涉及Keap1基因启动子的甲基化修饰，另一方面也可能与Keap1 mRNA的m6A甲基化有关。此外，有文献报道 Nrf2蛋白第437位精氨酸的甲基化修饰能够增强其与ARE区域的结合能力[29]。已有研究表明甜菜碱能够促进某些蛋白质（如信号传导及转录激活蛋白1）中精氨酸的甲基化修饰[30]。这暗示着甜菜碱还可能通过Nrf2蛋白的甲基化来影响Nrf2与ARE的结合，进而影响Nrf2-Keap1-ARE通路。也就是说图2a中的结果除了与进入细胞核内的 Nrf2蛋白水平有关，还可能与Nrf2蛋白的甲基化有关。事实上，机体调节Nrf2-Keap1-ARE通路的机制多种多样，如Nrf2蛋白的乙酰化修饰、抑制Keap1 mRNA的翻译等[12，31]。因此，甜菜碱激活Nrf2-Keap1-ARE通路的机制还有待进一步探究。