基于网络药理学方法初探葛花解酒涤脂汤抗酒精性脂肪肝作用

吴雪莉，冯 晓，郝 杰，易 旭

酗酒是世界范围内肝脏疾病的主要原因之一。大量乙醇摄入会加速肝脏脂肪生成、促进脂肪酸从血液进入肝脏，使脂蛋白滞留肝脏，肝细胞线粒体对脂肪酸的氧化功能减退、肝脏对脂肪消耗减少等不良作用，进而引起肝脏细胞损伤，导致酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)。

课题组经过长期临床积累，根据AFLD辩证论治、遣方用药的经验加以归纳总结，自拟出由葛花、葛根、白茯苓、绵茵陈、小青皮、甘草、决明子、山楂和明矾组成的葛花解酒涤脂汤，前期动物实验[1-2]已表明该方对酒精性脂肪肝有明显的治疗作用。但由于中药成分的多样性和作用机制多靶点、多环节等特点，葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的主要作用机制仍不明确。与中医整体观念一致的网络药理学能系统地、整体地揭示疾病-疾病、疾病-靶点蛋白、靶点蛋白-药物、药物-药物之间的联系。近年来，网络药理学已被逐渐应用中医药研究中，对进一步发现药效物质、探索分子作用机制和阐释其科学内涵具有重要的价值[3]。该研究运用网络药理学的方法初探葛花解酒涤脂汤治疗酒精性脂肪肝的潜在活性化合物及其可能的作用靶点，以期为葛花解酒涤脂汤后续的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 中药-化合物数据集的建立自中国传统医学百科全书(the encyclopedia of traditional chinese medicine，ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/)和SymMap(https://www.symmap.org)数据库对葛花解酒涤脂汤中所含9味中药进行化合物筛选。化合物的筛选条件为：ETCM数据库中“Druglinkness Grading”为“Moderate”或“Good”；SymMap数据库中口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%。选取符合条件的化合物作为候选化合物，建立中药-化合物数据集。

1.2 化合物-靶点数据集的建立根据1.1中筛选得到的候选化合物的CAS号或PubChem ID，于PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找化合物对应的“Canonical SMILES”结构。将化合物的该结构输入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)，限定物种为人(Homo sapiens)，依据成分的“Canonical SMILES”结构进行靶点预测，选取“Probability”大于0的靶点作为化合物对应的靶点，建立葛花解酒涤脂汤化合物-靶点数据集。

1.3 疾病数据集建立以“alcoholic fatty liver”为检索词，于GeneCards数据库(https://www.genecards.org)获取AFLD相关靶点，建立AFLD靶点数据集。

1.4 药物-靶点-疾病数据集建立通过Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，将1.2中化合物-靶点数据集与1.3中AFLD靶点数据集进行映射，得到葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的作用靶点。

1.5 葛花解酒涤脂汤-靶点-AFLD的PPI网络构建与分析将映射后获得的葛花解酒涤脂汤治疗AFLD作用靶点经STRING数据库(https://string-db.org)分析获得蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，设置最低相互作用阈值为“High confidence(0.900)”，其它参数均保持默认设置。随后将结果导入Cytoscape(3.6.0)软件构建葛花解酒涤脂汤靶点-AFLD的PPI网络。运用Cytoscape软件中Network Analyzer分析葛花解酒涤脂汤-靶点-AFLD PPI网络的自由度，根据自由度筛选核心靶点，将自由度>50的靶点纳入筛选范围。

1.6 核心靶点生物功能和通路富集分析运用Cytoscape(3.6.0)软件中的ClueGo插件对筛选得到的葛花解酒涤脂汤治疗AFLD核心靶点进行GO功能富集，以了解方药可能的功能涉及。再结合KEGG通路富集分析，拟获得方药治疗AFLD的相关信号通路。富集条件均设定为P<0.05。

2 结果

2.1 葛花解酒涤脂汤中候选化合物及其作用靶点筛选结果根据候选化合物的筛选条件，在ETCM和SymMap数据库中收集到的葛花解酒涤脂汤中候选化合物数量分别如下：葛花、葛根、白茯苓、绵茵陈、小青皮、甘草、决明子、山楂、明矾中分别有74、6、6、33、13、49、15、4、1个候选化合物。共计201个候选化合物。

在Swiss Target Prediction数据库中筛选出201个候选化合物对应靶点，依据成分的Canonical SMILES结构进行靶点预测，去除重复项后筛选出900个靶点作为葛花解酒涤脂汤的预测靶点。将所得的葛花解酒涤脂汤预测靶点与GeneCards数据库获取的3 763个AFLD相关靶点相映射，筛选出葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的候选作用靶点575个(图1)。

2.2 PPI网络分析及葛花解酒涤脂汤治疗AFLD潜在活性化合物筛选结果将葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的575个候选作用靶点导入String数据库，建立PPI网络数据。此网络共有575个节点，3 841条边，网络平均节点数13.4。通过Cytoscape软件，对该PPI网络进行分析，结果显示其中自由度>50的靶点共有17个，选取这17个靶点作为葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的核心预测靶点(表1)。其中自由度>80的靶点为PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP，该结果表明葛花解酒涤脂汤治疗AFLD主要涉及PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP四个关键靶点。这四个关键靶点涉及葛花解酒涤脂汤中的66个候选化合物，中药-候选化合物-靶点网络图见图2。但这66个候选化合物中，因部分化合物暂无法分离得到单体，因此葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的潜在活性化合物共有19个(表2)。

2.3 核心靶点的生物功能和通路富集分析运用Cytoscape(3.6.0)软件中的ClueGo插件对筛选得到的葛花解酒涤脂汤治疗AFLD核心靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，见图4、5。在GO功能富集分析结果中，共确定了46个条目，其中与分子功能(molecular function)相关的有6条，涉及蛋白质磷酸化、蛋白质酪氨酸残基磷酸化、胰岛素受体底物结合、Tau蛋白结合等分功能；与生物学过程(biological process)相关的有40条，其中排名前十的生物学过程主要涉及吞噬过程中免疫应答调节的细胞表面受体信号通路、吞噬过程中Fc-γ受体信号通路、血管内皮生长因子受体信号通路、星形胶质细胞分化等方面。通过KEGG通路富集分析，共得到23条相关通路，其中炎症相关通路有7条，激素相关通路4条；该结果提示葛花解酒涤脂汤治疗AFLD可能是通过炎症相关通路、激素相关通路、自噬、调节脂肪细胞脂解等信号通路调控。

表2 葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的潜在活性化合物

3 讨论

在我国，酒精性肝病成为仅次于非酒精性脂肪肝的第二大导致肝硬化和肝细胞癌相关死亡的原因。脂肪肝是90%以上酗酒者对过量饮酒最早的反应，是酒精性肝病发展为AFLD的重要因素。

图3 GO功能富集气泡图

图4 KEGG通路富集气泡图

课题组前期研究已表明[1-2]葛花解酒涤脂汤对酒精性脂肪肝小鼠具有显著的治疗作用，但其治疗AFLD的活性物质不清且作用机制不明。如果继续沿用传统的“一个靶点，一种疾病，一个药物”的研究模式，已很难系统、整体地阐明葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的作用机制，并且还会耗费大量的时间、精力。随着现代科技进入大数据时代，系统生物学和生物信息学等交叉学科的快速兴起，国内外学者开始从复杂网络的角度探索疾病与药物的系统性研究方式，“网络药理学”这一新学科由此开端并得到快速发展。它基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用的网络基础，通过分析基因网络库、蛋白网络库、疾病网络库、药物网络库等现有数据库的信息资料，结合从实验中获得的数据，利用专业网络分析软件及算法，系统、整体的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶点蛋白、靶点蛋白-药物、药物-药物之间的联系。且网络药理学注重药物作用网络及生物网络的整体性和系统性，关注基因、蛋白等在生物网络中的生物学地位和动力学过程，而并非对其作用单一靶标，认为药物作用的是疾病病理网络，以多维视角理解疾病和分析疾病，这一理念与中医整体观念一致。网络药理学能较好、较全面地运用于中药治疗疾病作用机制的研究，本研究采用网络药理学探索葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的作用机制。结果显示，葛花解酒涤脂汤可能通过炎症反应相关通路、激素相关通路、凋亡相关信号通路等信号通路防治AFLD。

本研究中KEGG富集到葛花解酒涤脂汤干预AFLD的相关炎症通路共有7条，分别为Chemokine信号通路、C-type lectin receptor信号通路、Sphingolipid信号通路、FoxO信号通路、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、TNF信号通路和IL-17信号通路。此外，还富集到凋亡、自噬和脂质代谢等通路，这些通路都可通过炎症反应发挥其在AFLD中的作用[4-5]，因此，课题组认为葛花解酒涤脂汤治疗AFLD主要是通过抗炎发挥其药效作用。已有研究表明AFLD患者体内炎症水平很高[6]，而改善肠道菌群是治疗AFLD的手段之一[7]，且这种治疗手段主要是通过抗炎发挥疗效[8]。故而作者认为抗炎在葛花解酒涤脂汤治疗AFLD中发挥了重要作用。

另外，本研究运用网络药理学的方法对葛花解酒涤脂汤抗AFLD的潜在活性化合物进行初探。结果显示，葛花解酒涤脂汤中有19个化合物涉及PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP四个核心靶点，所以作者认为这19个化合物可能是葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的潜在活性化合物，而其中乔松素[9]、柚皮素[10]、大黄酚、决明蒽醌和大黄素甲醚[11]、槲皮素[12]、山奈酚[13]、异甘草素[14]、染料木素[15]9个潜在活性化合物的抗ALFD活性已被相关文献证实。余下10个化合物的抗ALFD活性有待进一步研究。

综上所述，通过网络药理学的方法，从理论上不仅肯定了葛花解酒涤脂汤治疗AFLD的有效性，还揭示了葛花解酒涤脂汤抗AFLD的潜在活性化合物。这一结果为进一步研究AFLD发生及葛花解酒涤脂汤干预作用机制提供指导依据。