LSS基因功能缺失对雄性小鼠生殖的影响

孙晓梅，李名聪，2，李 涛，魏 翔，葛若木，张 军，李昱昊，周 青，汪 渊，张胜权，张素梅

不育症影响了全球8%～12%的夫妻，其中男性因素约占50%。男性不育与损害精子发生有关[1]。精子发生是一个高产且高度组织化的过程[2]，精子发生是从二倍体精原干细胞(spermatogonial stem cell，SSC)提供单倍体精子的细胞分化过程。睾酮、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)等激素的缺失会引起生殖细胞凋亡[3]。胆固醇是哺乳动物细胞生长和生存所必需的，并且是性激素合成的前体[4]。羊毛固醇合成酶(lansterol synthase，LSS)是胆固醇合成途径中的一个关键酶，催化(S)-2,3-环氧角鲨烯转化成羊毛固醇。LSS双等位基因突变的患者不仅会表现少毛症、白内障、脱发伴智力低下(alopecia with mental retardation，APMR)综合征、隐形神经外胚层综合征等疾病，还会出现小阴茎的现象[5-7]。有研究[8]显示，LSS抑制剂会降低前列腺癌细胞的活力，并在体外诱导细胞凋亡。该研究通过LSS敲除小鼠模型，探讨LSS基因缺陷对雄性小鼠生殖功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

1.1.1实验动物 实验采用的动物均为C57BL/6品系，LSS基因敲除的F1代小鼠购自南京大学南京生物医药研究所，于安徽医科大学动物中心SPF级环境中饲养及配繁，动物饲养环境严格保证在温度为(20±2)℃， 相对湿度为40%～70%且明暗交替时间12/12 h的环境下，自由进食水。所有实验动物的操作与饲养均符合国标及安徽省实验动物中心管理饲养条例。

1.1.2主要试剂 Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 Plus dye)和DL2000 bp DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；鼠尾基因型鉴定试剂盒购自上海碧云天生物公司；LSS基因引物由南京大学南京生物医药研究所设计，引物及琼脂糖粉末购自生工生物工程(上海)股份有限公司，LSS引物序列为：Primer F：5′-ACCTCTGCGGAGTCTAAGGAAG-3′、Primer R：5′-AAGGCTCTTCACTGTTTCAGAGCT-3′；Tubulin购自上海Abmart公司；LSS/Bax/Bcl-2购自美国Santa Cruz公司、GPX4购自美国Thermo Scientific公司；所有使用的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3仪器 DYY-6C电泳仪购自于北京市六一仪器厂；普通PCR仪购自美国赛默飞公司；酶标仪(1510)购自美国Thermo Scientific公司；制冰机(SCOTSMAN)购自德国Leica公司；全自动数码凝胶图像分析仪购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1小鼠基因型鉴定 ① 鼠尾基因组DNA提取：将DNA Extraction Solution 和 Enzyme Mix 按照48 ∶2的比例充分混匀，配制成消化液。剪取0.2～1 cm的小鼠尾尖放置于250 μl的PCR管内，向其中加入配置好的消化液50 μl。将样品置于PCR仪中，55℃、15 min，95℃、5 min，结束后加入50 μl Stop Solution，在涡旋器上混匀，以提取小鼠基因组DNA。② PCR扩增：PCR扩增反应体系(25 μl)：12.5 μl Premix Taq 、1 μl F引物(10 μmol/L)、1 μl R引物(10 μmol/L)、1 μl DNA模板、加入灭菌ddH2O 9.5 μl。采用PCR扩增仪进行循环扩增，反应条件：预变性94 ℃、3 min ，变性94 ℃、30 s，退火55℃、30 s，延伸72℃、40 s，循环35次，72℃、10 min终止反应。③ 琼脂糖凝胶电泳：取PCR产物5 μl，在1.6%琼脂糖凝胶中及电压90 V下，电泳90 min，于化学发光凝胶成像系统中进行拍照分析。④ 基因型结果判定：根据PCR扩增产物长度来进行判断，扩增产物在328 bp左右的为野生型(WT),扩增产物在328 bp和282 bp左右两条带均存在的为杂合子(LSS+/-)。

1.2.2生育力检查 将8周龄的鼠按基因型和雌雄不同，分组配繁，第一批WT型和KO型雌雄各取2只，共8只鼠；第二批WT型雌雄各取5只，KO型鼠雌雄各取6只，共22只，两批总计30只鼠，分别按♂WT×♀WT、♂WT×♀KO、♂KO×♀WT、♂KO×♀KO进行1：1合笼，时长4个月，统计每胎平均生仔个数、产仔周期。

1.2.3性激素检测 取雄性WT型和KO型小鼠各10只，留取血清检测性激素。

1.2.4TUNEL染色观察睾丸中生殖细胞凋亡情况 常规制备石蜡切片，脱蜡、水合，加入细胞通透液8 min，PBS漂洗2次，滴加TUNEL反应混合物，37℃孵育1 h,冲洗样品，在荧光显微镜下观察分析，滴加转化剂-POD,37℃孵育30 min，洗样品，滴加DAB底物溶液，室温孵育10 min，光学显微镜镜下观察凋亡细胞并拍照。

1.2.5Western blot检测凋亡相关蛋白表达 根据小鼠睾丸组织的大小，加入适量的裂解液以提取总蛋白，在BCA法检测蛋白浓度后，采用SDS-PAGE凝胶电泳，配置相应浓度的胶，分离蛋白并转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h，加入相应的一抗，4℃过夜，加入对应的由辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，每步结束后，均要用TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL化学发光剂进行显色，用Image J软件进行灰度值分析，计算蛋白表达情况。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定结果和LSS蛋白表达提取鼠尾DNA进行PCR扩增，电泳后的结果如图1所示：其中1、3、6、7、8号只出现一条328 bp左右的条带，为野生型(WT)；2、4、5、9、10号出现328 bp和282 bp左右的两条带，为杂合子(LSS+/-)；与WT型相比，基因敲除小鼠的LSS蛋白表达量降低(t=18.00,P<0.05)。见图1。

图1 小鼠PCR基因型鉴定和Western blot 法检测LSS蛋白在野生型和杂合子小鼠睾丸组织中表达水平的结果

2.2 LSS基因缺陷对雄性小鼠生育力可能有影响4组两两比较，平均产仔周期(F=1.837，P=0.155)差异均无统计学意义；每胎平均生仔个数(F=4.602，P=0.007)，差异有统计学意义，根据SNK-q检验分析显示♂WT×♀WT与♂KO×♀KO组比较有差异，其余组别差异均无统计学意义(表1)。

表1 LSS基因缺陷对雄性生育力无影响(n=30)

2.3 LSS基因缺陷对雄性小鼠性激素无影响采用独立样本Mann-Whitney U检验对KO型与WT型小鼠两组分析，性激素五项水平差异均无统计学意义，表明LSS基因敲除对C57小鼠性激素水平无影响(表2)。

2.4 TUNEL染色观察睾丸中生殖细胞凋亡情况TUNEL阳性细胞为红色颗粒的细胞，TUNEL染色结果显示，凋亡细胞多存在于精原细胞和精母细胞，凋亡细胞染色较深，可见细胞核固缩、裂解等形态学改变。WT组的睾丸组织中很少见到凋亡细胞，KO 型小鼠睾丸组织凋亡细胞增多(图2)。

图2 6只野生型和杂合子小鼠睾丸TUNEL染色的结果WT:野生型小鼠对照组；KO:基因杂合敲除型小鼠

2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白表达基因缺陷小鼠的睾丸组织中，凋亡相关蛋白Bax(t=0.340,P=0.751)、Bcl-2(t=0.962,P=0.390)、GPX4(t=0.641,P=0.557)与野生型小鼠相比，差异均无统计学意义(图3)。

3 讨论

LSS在胆固醇合成途径的关键环化反应中合成羊毛固醇。LSS在胆固醇合成过程中起决定性作用，它可能成为新型抗胆固醇药的目标，也可以确定为抗心绞痛药物吗多明的靶标[9-11]。而LSS功能缺失对小鼠生殖功能的影响至今未有文献报道。

本研究结果表明，当LSS基因敲除后，与野生型小鼠相比，小鼠睾丸组织TUNEL染色结果显示，KO型小鼠生精细胞凋亡水平高于WT型小鼠。两组配繁结果显示生仔周期无差异，每胎平均生仔个数当雌雄均为LSS型小鼠时有差异，性激素水平相比也无差异。用 Western blot 法检测凋亡相关蛋白在野生型和杂合子小鼠睾丸组织中表达水平时，显示促凋亡相关蛋白Bax和抗凋亡相关Bcl-2的蛋白表达无差异，表明睾丸组织生精细胞发生凋亡可能不是通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡刺激物。由于GPX4是一种可以修复脂质过氧物，抑制其触发由脂质膜的氧化损伤驱动的一种细胞死亡(铁死亡)[12]，本研究结果显示GPX4蛋白表达无差异，表明引起睾丸组织生精细胞发生凋亡的不是因为铁死亡这条凋亡通路。参与细胞凋亡的途径众多，介导LSS敲除小鼠生精细胞凋亡的蛋白和分子机制尚有待进一步研究。此外，研究[13]表明：他汀类药物(羟甲基戊二酸单酰CoA抑制剂)可通过降低类固醇激素睾酮的生成和精子膜胆固醇的量来对男性生殖有负面影响。也有研究[14]发现对仓鼠和狗中使用LSS抑制剂治疗后，在身体多个部位观察到组织病理学变化，而睾丸病变的特征是睾丸萎缩，生殖细胞耗竭和变性、生精小管塌陷及前列腺和精囊萎缩变小等。本研究在LSS基因杂合敲除小鼠中观察到睾丸生精细胞凋亡水平高于WT型小鼠，提示、LSS基因敲除通过抑制睾丸生殖细胞生产而抑制小鼠生殖能力。

表2 LSS基因缺陷对雄鼠性激素水平无影响 (n=10)