TAK-733对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞生物学行为影响的研究

郑 朦，魏 枫，邵 国，王晓艳，程 冉，张 苑

甲状腺癌(thyroid cancer，TC)是内分泌系统最为常见的恶性肿瘤，其中，人甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)占所有TC的70%～80%，是最常见的类型[1]。目前国际上公认的PTC常规治疗手段为“手术+131I+促甲状腺激素(TSH)抑制治疗”[2]，大多数患者预后良好，但仍有1/3的患者出现复发[3]。已知PTC的发生、发展与某些信号通路的活性改变存在密切联系。其中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的过度激活是其中最为常见的遗传学变异，与细胞的增殖、凋亡和迁移等生物学行为密切相关[4]。近年来随着分子生物学研究的不断深入，特异靶向信号通路关键分子的抑制剂成为新药研发的重点[5]。(R)-3-(2,3-二羟丙基)-6-氟-5-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-8-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733)是一种高效选择性的非ATP竞争性MEK 1/2激酶变构抑制剂，于2011年被首次合成。de la Puente et al[6]研究表明TAK-733在多发性骨髓瘤中表现出抗肿瘤活性，其可抑制多发性骨髓瘤U266细胞增殖，诱导细胞凋亡,并且促进细胞发生G1期阻滞。该研究以人甲状腺乳头状癌(thyroid papillary carcinoma,TPC)-1细胞为研究对象，通过体外细胞初步探讨TAK-733对PTC的影响,为PTC的药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株 人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞购自上海复旦细胞库。

1.1.2药物与试剂 TAK-733购自美国MCE公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)、青链霉素混合液购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)和MTT粉末购自美国Sigma公司；碘化丙啶(PI)和细胞凋亡试剂盒Annexin V-FITC购自大连美仑生物技术有限公司；RNA酶(RNase A)购自北京天根生物科技公司

1.1.3实验仪器 3111型CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；ELX-800全自动酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；FACSCantoTMⅡ流式细胞仪(美国BD 公司)；TE2000-U倒置相差显微镜(日本Nikon公司)

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 TPC-1细胞用含10% FBS，1%青链霉素混合液的RPMI 1640完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养。

1.2.2实验分组 将人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞分为实验组和对照组，各实验组的药物浓度梯度分别为2.5、5、10 μmol/L，对照组加入普通培养基。

1.2.3溶液配制 按照产品说明书写明的方法使用DMSO将TAK-733粉末完全溶解，配制成终浓度为20 mmol/L的储存液。实验过程中用RPMI 1640培养基将其稀释成终浓度为2.5、5、10 μmol/L的工作液，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.4MTT比色分析法检测细胞增殖抑制率 取处于对数生长期的TPC-1细胞，以3×104个/ml 接种于96孔板中，每孔加入100 μl细胞培养液。培养过夜后实验分组同1.2.2,每组设6个复孔。药物干预24、48、72 h后，向各孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，继续培养4 h，弃去培养基加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，使紫色结晶充分溶解。将酶标仪波长设为490 nm，检测各孔吸光度值(OD值)，计算细胞的增殖抑制率，抑制率=(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%。独立重复实验3次。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期 将TPC-1细胞以1×106个/皿密度接种于 60 mm培养皿，细胞贴壁后实验分组同1.2.2，分别于24、48 h后用胰蛋白酶消化收集细胞，1 200 r/min离心5 min后用提前预冷的PBS洗2次，收集细胞沉淀于75%冷乙醇中固定过夜，24 h后1 200 r/min离心5 min，弃去乙醇，PBS洗2次，PBS重悬细胞，加入RNase A，37 ℃水浴30 min，加入PI染料，室温下染色30 min后应用流式细胞仪分析488 nm处激发波长荧光强度。独立重复实验3次。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞的接种培养及分组同1.2.5。药物干预24、48 h后收集各组细胞，1 200 r/min离心5 min,预冷PBS洗涤2遍,1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1×Binding Buffer 500 μl重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混匀,室温避光孵育10～15 min，然后以流式细胞仪上机检测分析。独立重复实验3次。

1.2.7划痕愈合试验检测细胞迁移能力 取处于对数生长期的TPC-1细胞，消化离心后将细胞按5×105个/ml的密度接种至6 孔板，每孔2 ml细胞悬液。待细胞贴壁后，用200 μl枪头于培养孔正中处垂直划线，PBS 缓冲液清3次，实验分组同1.2.2项。荧光倒置显微镜下分别拍照记录0 h和24 h的划痕区域面积; 迁移率(%)=(1-24 h划痕区域面积/0 h划痕区域面积)×100%。独立重复实验3次。

2 结果

2.1 不同浓度TAK-733对TPC-1细胞增殖的影响MTT实验显示，比较3个浓度实验组与对照组的细胞增殖抑制率,差异均有统计学意义 (P<0.05)。当处理时间一定时，随着TAK-733的浓度增加，TPC-1细胞的增殖抑制率逐渐增高(F=336.822、671.322、1 498.396,P<0.05)；且相同浓度的TAK-733在不同的作用时间点，随着作用时间的不断延长，TPC-1细胞的增殖抑制率也逐渐增高(F=86.547、296.955、296.222,P<0.05)，TAK-733对TPC-1细胞生长的抑制作用呈时间和剂量依赖性。见表1。

表1 不同浓度TAK-733对TPC-1细胞增殖抑制率的影响

2.2 不同浓度TAK-733 对 TPC-1细胞周期的影响流式细胞术检测TAK-733实验组和对照组细胞周期，结果显示相比于对照组，随着TAK-733处理浓度增加，G1/G0期细胞比例逐渐增多(F=58.536、179.347,P<0.05)，S期(F=34.894、76.293,P<0.05)和G2/M期(F=24.192、96.688,P<0.05)细胞比例相对减少，差异有统计学意义。而当处理浓度一定时，随着时间的延长，G1/G0期细胞比例亦逐渐增多(t=-10.447、-12.209、-8.839,P<0.05)，S期(t=8.003、9.682、10.342，P<0.05)和G2/M期(t=6.112、10.220、3.349，P<0.05)细胞比例逐渐减少，差异有统计学意义。说明细胞发生G1/G0阻滞，此时TPC-1细胞的生长停滞，且这种抑制作用随着作用浓度的增加和时间的延长而逐渐加强。见表2及图1、2。

表2 不同浓度TAK-733作用不同时间对TPC-1细胞周期的影响

图1 不同浓度TAK-733对TPC-1细胞作用不同时间细胞周期的分布图

图2 不同浓度TAK-733对TPC-1细胞作用不同时间细胞周期的百分比

2.3 不同浓度TAK-733 对TPC-1细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，各实验组凋亡率均增高，处理时间一定时，随着TAK-733浓度的增加，凋亡率逐渐增加，差异有统计学意义(F=59.929、94.542,P<0.05)。并且相同浓度的TAK-733作用48 h后的凋亡率高于24 h，差异有统计学意义(t=-4.888、-4.962、-4.275，P<0.05)。见图3、4。

2.4 不同浓度TAK-733 对TPC-1细胞迁移的影响不同浓度的TAK-733作用于TPC-1细胞后，TPC-1细胞的迁移能力不同，实验组的划痕愈合率均小于对照组，差异有统计学意义 (F=37.086,P<0.05)，且随着TAK-733浓度的增加，划痕愈合率亦逐渐降低。见图5、6。

3 讨论

作为最常见的内分泌癌，TC约占全身恶性肿瘤的1%[7]。近年来TC的发病率呈现明显的上升趋势，其中以PTC情况最为突出。尽管PTC常规治疗后总体预后良好，5年生存率可达到98%[8]，但出现复发和转移的部分患者仍然值得关注。为了降低术后复发的风险、改善患者的生存状况，从分子生物学层面深入了解恶性肿瘤的相关致病机制已经成为当前研究的热点。近年来，靶向药物在恶性肿瘤的中晚期治疗中的成功应用被广泛认可，为广大患者带来了福音与希望。因此，靶向药物的开发与利用是当前肿瘤治疗的潮流所向。

图3 不同浓度TAK-733作用不同时间的TPC-1细胞凋亡率的分布图

图4 不同浓度TAK-733作用不同时间对TPC-1细胞凋亡率的影响

Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的过度激活被认为在多种恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用。现有研究[9-11]已证实，在PTC中亦存在Ras/Raf/MEK/ERK信号通路过度激活。该信号通路的激活在于Raf、MEK、ERK依次发生磷酸化[12]。磷酸化的ERK进一步影响其下游重要的信号分子，从而调控细胞的增殖、分化、迁移等重要的生理活动。在整个通路中，ERK是MEK下游的唯一底物，这无疑表明了MEK在通路中至关重要的地位。近年来，关于针对MEK抑制剂的研发得到了广泛关注。TAK-733作为一种新型的MEK 1/2抑制剂，可选择性结合并抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路上的关键信号分子MEK 1/2的活性，从而阻止了依赖MEK 1/2的效应蛋白和转录因子的激活，尤其对MEK 1/2下游靶点ERK 1/2的磷酸化有明显的抑制作用[13]。多项研究证实,TAK-733在多种恶性肿瘤中可发挥抗肿瘤作用。von Euw et al[14]体外细胞研究提示TAK-733干预后黑色素瘤细胞增殖受到抑制，细胞发生G1期阻滞。Baranski et al[15]通过实验表明TAK-733作用于骨肉瘤细胞后，可引起MOS和U2OS两种细胞的凋亡蛋白Caspase 3/7显著增加。

图5 不同浓度TAK-733处理TPC-1细胞24 h的划痕分布

图6 不同浓度TAK-733对TPC-1细胞迁移的影响

MTT实验结果显示，不同浓度TAK-733处理TPC-1细胞24、48、72 h后，实验组细胞增殖抑制率均高于对照组，且低、中、高剂量组细胞增殖抑制率依次增高,均随处理时间的延长而增高，这与Micel et al[13]对黑色素瘤细胞的研究中显示TAK-733可抑制细胞的增殖结果类似。因此，可推断TAK-733作用于人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞，MAPK/ERK通路的的活化程度被抑制后细胞的增殖能力减弱。

为对TAK-733抑制TPC-1细胞增殖的相关作用机制进行更深一步的探索，该研究采用了流式细胞术对细胞周期进行检测分析。结果显示，与对照组相比，以不同浓度TAK-733分别处理TPC-1细胞24、48 h后，TPC-1细胞的G1/G0期细胞比例均上升，而S期和G2/M期细胞比例则相对降低。随着TAK-733浓度的逐渐增加和处理时间的延长，G1/G0期细胞比例逐渐增高，S期和G2/M期细胞比例逐渐降低。提示TAK-733可阻滞细胞周期，使TPC-1细胞发生G1/G0期停滞，细胞分裂不能继续往下进行，从而抑制癌细胞的增殖。

该研究还采用Annexin V-FITC/PI双染法对细胞凋亡进行了检测。以不同浓度TAK-733分别处理TPC-1细胞24、48 h。与对照组相比，不同浓度的TAK-733干预后细胞的凋亡率均增高，且低、中、高剂量组细胞凋亡率依次增高,各组凋亡率均随处理时间的延长而增高。进一步证实TAK-733可促进TPC-1细胞的凋亡。

此外，该研究还通过划痕愈合实验初步研究肿瘤细胞的迁移能力,通过计算细胞实验组与对照组的划痕愈合率来判断细胞迁移能力的强弱。实验中观察到与对照组相比，低、中、高浓度的TAK-733干预TPC-1细胞24 h后细胞的划痕愈合率均降低，且随着TAK-733浓度的逐渐增加，划痕愈合率逐渐降低。提示TAK-733在PTC的发展中可抑制TPC-1细胞的迁移，从而发挥强大的抗肿瘤作用。

综上所述，TAK-733能通过将TPC-1细胞阻滞于G1/G0期而抑制细胞的增殖和迁移, 促进癌细胞凋亡。该研究为PTC的靶向治疗提供了新的思路。