阿维霉素干预MTIF2调控核糖体翻译进程抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究

常 凯，那琬琳，刘晨霞，江忠勇，王艳艳，许宏宣，沈金兰，刘 媛

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是人类主要的传染病之一，目前经食药监局批准用于治疗乙型肝炎的药物主要包括干扰素类及核苷酸类似物两大类[1]。然而干扰素的副作用以及核苷酸类似物的耐药性使得抗HBV的治疗方法受到极大限制[2]。

阿维霉素又称为卑霉素、阿维拉霉素，属于正霉素族的寡聚糖类抗生素。主要是由绿色产色链霉菌Tü57发酵产生的一种次级代谢产物，呈无色针状结晶，微溶于水，易溶于丙酮、丙醇、乙酸乙酯、苯和乙醚等有机溶剂[3]。已发现其具有抑制多种革兰阳性菌的功效，如耐万古霉素的肠球菌、耐甲氧苯青霉素的葡萄球菌等。然而其对革兰阴性菌的抑制效果欠佳。临床与基础医学研究[4]发现，包含阿维霉素在内的正霉素类抗生素是一种能够有效作用于trGTPases的抑制剂。而trGTPases直接作用核糖体翻译合成起始蛋白质，参与病毒在宿主体内的复制[5-6]。因此该研究旨在探讨宿主细胞中阿维霉素对HBV复制的抑制作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料人肝癌细胞系 Hep3B，含HBV基因组，购于成都诺和生物科技有限公司。阿维霉素(CAS11051-71-1)(加拿大多伦多研究化学品公司)，胎牛血清(新西兰 Gibco公司)。DMEM培养基、PBS、青霉素链霉素双抗购于美国Gbico 公司；Cell Counting Kit(CCK-8)购于日本同仁公司；细胞凋亡Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购于上海碧云天公司；总RNA提取试剂盒、乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购于中山大学达安基因股份有限公司。TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)和乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)购于北京万泰生物药业股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人肝癌细胞Hep3B 培养基：DMEM 高糖培养基、1%青链霉素双抗、10%胎牛血清。培养条件：5% CO2，37 ℃，湿度为 36%。

1.2.2CCK-8检测细胞活性 Hep3B细胞按每孔1×104个细胞的浓度接种于 96 孔板，制备细胞悬液。经18 h待细胞贴壁后，加入与配置好的含不同浓度阿维霉素的培养基200 μl(阿维霉素浓度分别为0、10、25、50 μg/ml)。加药培养18、24、48 h 后吸出上清液，每孔加入10 μl CCK-8溶液，再加入90 μl培养基，放入CO2培养箱内孵育3 h，使用酶标仪测定450 nm初的吸光度(optical density，OD)。各浓度阿维霉素对Hep3B细胞的抑制率=(对照组OD值-用药组OD值)/(对照组OD值-调零孔OD值)[7]。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡 将人肝癌细胞Hep3B分别接种于6孔板中，接种浓度为 1×104个细胞/孔，待18 h细胞贴壁后，加入含不同浓度阿维霉素的培养基(0、10、25、50 μg/ml)。18 h 后处理消化和洗涤细胞，再加入5 μl AnnexinV-FITC，室温，避光，轻轻混匀避光10 min；加入5 μl PI室温避光孵育5 min，加入PBS适量，轻轻混匀后应用流式细胞仪检测细胞凋亡；用70%的冰乙醇固定 24 h，PI染色后流式细胞仪检测。

1.2.5ELISA法检测 阿维霉素对培养细胞上清液中的 HBsAg、HBeAg，qPCR 检测阿维霉素对细胞培养上清液 HBV DNA 的影响 将 Hep3B 置于T25培养瓶，细胞浓度为1×105个/ml，分别添加阿维霉素浓度为0、10、25、50 μg/ml的培养基孵育细胞18 h，收集上清液离心5 min(1 500 r/min)，收集上清液用于检测HBV DNA、HBsAg和HBeAg。

1.2.6提取mRNA 应用总RNA提取试剂盒提取总RNA，收集经阿维霉素(浓度0、10、25、50 μg/ml)处理后的18 h的细胞及上清液，使用离心柱提取法提取RNA，应用荧光定量PCR检测MTIF2基因和pgRNA表达量。

1.3 统计学处理应用SPSS v24.0软件对数据结果进行统计分析，实验结果采用表示。符合正态分布规律数据组间比较使用独立样本t检验；数据间比较使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 阿维霉素对细胞生长的影响阿维霉素对Hep3B细胞的生长未发现抑制作用，48 h内也未表现出浓度和时间依赖性。表1显示阿维霉素对Hep3B没有生长和活性抑制作用。

表1 阿维霉素对Hep3B细胞生长活性的影响(%)

2.2 阿维霉素对细胞死亡和凋亡影响阿维霉素对Hep3B细胞没有促进凋亡作用。在不同阿维霉素浓度0、10、25、50 μg/ml处理后，结果见表2。处理组与对照组之间不存在差异，表明阿维霉素对肝癌细胞Hep3B的凋亡和死亡没有影响。

表2 阿维霉素对Hep3B细胞凋亡的影响

2.3 阿维霉素对HBV毒力的影响阿维霉素处理Hep3B细胞18 h后，应用Taqman引物qPCR检测HBV DNA浓度显示，不同浓度阿维霉素处理后均能降低HBV-DNA浓度，25 μg/ml降低幅度最大(F=4.03，P=0.005)。但HBV的pgRNA浓度均有不同程度增加，10 μg/ml阿维霉素处理后增加幅度最大(F=12.14，P=0.003)(图1A、B)。

2.4 阿维霉素对宿主翻译调控蛋白的影响不同浓度阿维霉素处理Hep3B细胞18 h，检测宿主细胞翻译调控蛋白RPL10和MTIF2的mRNA相对表达水平。显示阿维霉素能够使RPL10和MTIF2的mRNA表达水平增加，使RPL10在50 μg/ml的浓度(F=8.87，P=0.003)处理后增加最多，MTIF2增加最多的浓度也在50 μg/ml浓度(F=7.94，P=0.007)(图1C、D)。

2.5 阿维霉素对病毒合成蛋白的影响检测不同浓度阿维霉素处理后外泌HBV蛋白HBsAg和HBeAg的相对浓度，结果表明：不同浓度药物处理后HBsAg和HBeAg均表现出降低(图1E、F)。

2.6 阿维霉素对细胞外泌成分的影响经不同浓度阿维霉素处理后显示，Hep3B细胞外泌成分甲胎蛋白浓度降低。阿维霉素处理Hep3B细胞能够提高谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)浓度，且具有浓度依赖性。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)浓度在阿维霉素处理后没有规律。ALT在10 μg/ml阿维霉素处理后浓度增加(F=2.97，P=0.001)，但在25、50 μg/ml阿维霉素处理后其浓度降低(图2)。

2.7 阿维霉素抑制HBV复制的分子机制应用蛋白质互作分析软件STRING v11.0对宿主内的RPL10和MTIF2蛋白进行分析发现，共有7个蛋白质形成互作集团，分别为RPL10、MTIF2、RPL19、RPL35、RPL18A、RPS12和RPS16(图3A)。富集分析表明：7个蛋白质主要具有参与核糖体结构组成并影响翻译起始的功能，7个蛋白的亚细胞定位集中在细胞质线粒体和细胞质胞质中，主要参与病毒mRNA翻译和肽链的延伸信号通路。

图1 阿维霉素对HBV毒力、宿主核糖体调控基因和外泌蛋白的影响

图2 阿维霉素对Hep3B外泌蛋白的影响

基于该研究，课题组模拟了一个HBV在宿主细胞内可能存在的复制机制，即HBV利用宿主细胞的核酸复制转录系统形成一个共价闭合环状 DNA(cccDNA)。cccDNA以微型染色体形式存在于细胞核内，提供pgRNA在内的所有病毒 mRNA 的转录模板。pgRNA和mRNA同时翻译出多种用于病毒包装的蛋白，在胞质中组装形成核衣壳复合体用于形成新的病毒中间体。在该过程中，RPL10和MRIF2分别参与核糖体大亚基的组成和翻译起始。随后一部分中间体装配成成熟的病毒Dane颗粒释放入血；另一部分重新补充核内的cccDNA[8]。以此循环，大量增殖。该研究显示经阿维霉素处理，在翻译步骤前的基因pgRNA、RPL10和MTIF2等出现累积，翻译下游蛋白HBsAg、HBeAg和HBV-DNA浓度却降低。表明阿维霉素的作用位点位于核糖体翻译步骤(图3B)。

3 讨论

常见的正霉素类抗生素有阿维霉素和晚霉素等，其能够结合rRNA的H89的小沟到H91的环区，通过rRNA的扰动间接地赋予核糖体翻译起始抗性[9-10]。晚霉素一般不抑制肽键的形成，也不与其他几种抗生素竞争结合核糖体。阿维霉素则是通过干扰AA-tRNA与核糖体的结合影响翻译进程[11]。阿维霉素和晚霉素均被认为是很好的翻译起始抑制剂，它们以IF2依赖的方式抑制fMet的形成。然而抑制的确切步骤仍然不清楚。

MTIF2为翻译起始因子IF-2，多存在与线粒体和细胞质，是经典翻译因子GTPase家族中IF-2亚家族成员[12]。MTIF2是蛋白质合成起始的基本成分之一，能够保护甲硫酰-tRNA不被自发水解，并促进其结合到30S核糖体亚基[13]。同时也参与GTP在70S核糖体复合物的水解。在本研究中使用翻译起始抑制剂阿维霉素去抑制MTIF2功能，结果表明阿维霉素表现出对HBV组装必需蛋白的翻译抑制功能。

核糖体蛋白L10(RPL10)为核糖体大亚基的组成单元，然而在核糖体构成中并非所有的核糖体蛋白成员均需参加[14-15]。在已有研究中，包括HIV在内的多种病毒复制的翻译调控均有RPL10有关，结合本次研究结果，课题组推断宿主RPL10可能是特异性参与病毒翻译的核糖体蛋白。

本研究应用阿维霉素处理HBV细胞模型Hep3B，表明阿维霉素能够有效调控MTIF2功能，通过抑制翻译起始减少病毒组装所需蛋白的翻译，进而影响HBV复制，反馈导致MTIF2、RPL10和pgRNA等上游基因表达量增加。该研究与正霉素类抗生素预测结合位点相对于起始因子在核糖体上的结合位点相一致。

图3 RPL10和MTIF2蛋白PPI分析和阿维霉素参与HBV复制的机制分析A：RPL10和MTIF2蛋白PPI分析图；B：阿维霉素参与HBV复制的机制示意图