超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中的6种镇痛类化学成分

2022-03-04董亚蕾乔亚森黄传峰王海燕

分析测试学报 2022年2期

董亚蕾，乔亚森，黄传峰，王海燕，孙磊

（中国食品药品检定研究院，国家药品监督管理局化妆品研究与评价重点实验室，北京 100050）

随着化妆品市场规模的不断扩大，我国已成为世界上第二大化妆品消费市场。人们对化妆品的质量要求越来越高，同时对其安全性问题也日渐重视。为满足不同人群的需要，化妆品品类深度细分，各种不同目的、不同功效、不同使用场景的化妆品层出不穷［1］。但为盲目追求产品功效，不法生产商向化妆品中违规添加各类化学药物，导致皮肤不良反应甚至损害人体健康的事件时有发生［2］。例如，非那西丁是解热镇痛药，但会严重损害肾脏甚至诱发癌症，已被许多国家禁售。双氯芬酸钠和吲哚美辛是常见的非甾体类抗炎镇痛药物，使用不当会引发不良反应，甚至导致休克和衰竭。保泰松是吡唑酮类消炎镇痛药，具有祛痘、抗粉刺等功效，但长期使用会造成人体多器官慢性损伤。这些药物成本低廉，能够显著缓解疼痛，可被添加在祛痘、舒缓、防晒和晒后修复等化妆品中，以降低皮肤痛感，消费者在不知情的情况下长期使用，将会引起健康危害。

镇痛类药物的测定方法主要有电致发光法［3］、高效液相色谱法［4］、液相色谱-串联质谱法［5］，但已报道的研究大多集中在中成药［6-7］、保健食品［8］。目前关于化妆品中镇痛类药物的研究较少，我国也尚未制定相关的标准检测方法。根据文献报道，高效液相色谱法被用于测定化妆品中的保泰松［9］和氯苯那敏［10］，染发剂中的非那西丁［11］以及植物精油中的双氯芬酸钠［12］。超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）被用于同时测定祛痘类化妆品中的保泰松和氨基比林［13］。UHPLC-MS/MS 法高效快速、灵敏度高、准确度好，适合于痕量物质检测，在化妆品中非法添加化学药物的检测方面具有显著优势［14-15］。目前，同时测定化妆品中多种镇痛类药物的UHPLC-MS/MS法尚未报道。

本研究选择非那西丁、双氯芬酸钠、吲哚美辛、保泰松、氨基比林、氯苯那敏6 种镇痛类化学成分作为目标物，通过对前处理条件、色谱条件、质谱条件的优化，采用UHPLC-MS/MS 建立了同时测定膏霜、面膜、啫喱和喷雾等化妆品中6 种镇痛类化学成分的方法。该方法提高了检测灵敏度和检测效率，为化妆品安全监管工作提供了可靠的检测方法和技术支撑。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Triple Quad 4500 型高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；G10 型离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；Vortex-5 涡旋振荡器（江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ-700DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AL204型电子天平（美国Sartorius公司）。

非那西丁标准品（纯度100.0%，北京振翔科技有限公司）；双氯芬酸钠（100.0%）、吲哚美辛（99.9%）、保泰松（99.8%）、氨基比林（99.7%）、氯苯那敏马来酸盐（99.7%）标准品均来自中国食品药品检定研究院；乙腈、乙酸铵（质谱纯，美国Fisher公司）。

1.2 标准溶液配制

精密称取氨基比林、非那西丁、双氯芬酸钠、吲哚美辛、保泰松、氯苯那敏马来酸盐标准品10 mg，加入甲醇溶解，分别配制成质量浓度为1 mg/mL 的标准储备溶液备用，4 ℃避光保存。取适量标准储备液，分别用甲醇稀释成质量浓度为10 mg/L的标准中间液。分别取标准中间液适量，用50%乙腈稀释成质量浓度分别为5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的系列标准混合溶液。

1.3 样品前处理

称取化妆品样品0.2 g 于10 mL 具塞离心管中，加入2 mL 饱和氯化钠，充分涡旋混匀，加入5 mL乙腈，涡旋分散，超声提取5 min，以10 000 r/min 离心5 min。移取上清液，加入5 mL 乙腈重复提取1次，合并提取液。提取液用水稀释2倍，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，待测定。防晒喷雾类化妆品经超声去除推进剂后称样进行前处理。

1.4 液相色谱-串联质谱条件

1.4.1 液相色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL；流动相A：水（含5 mmol/L 乙酸铵），流动相B：乙腈（含5 mmol/L 乙酸铵）；流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0~10 min，5%~95%B；10~12 min，95%B；12~12.5 min，95%~5%B；12.5~14 min，5%B。

1.4.2 质谱条件离子化模式：ESI+；扫描模式：多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气压力：0.17 MPa；雾化气压力：0.38 MPa；辅助气压力：0.38 MPa。6种镇痛类药物的母离子、子离子、去簇电压（DP）、碰撞能（CE）等质谱参数见表1。

表1 6种化合物的质谱参数Table 1 MS parameters of the 6 compounds

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择向空白的膏霜、面膜、啫喱和喷雾化妆品基质中加入6 种待测化合物混合标准溶液，以该加标样品为研究对象，考察了甲醇、乙醇、乙腈3种常用有机试剂作为提取溶剂的效果。结果显示，在面膜和喷雾基质中，上述3种提取溶剂对6种化合物回收率的影响不大。但在膏霜基质中，采用甲醇作为提取溶剂时，6 种化合物的回收率低于乙醇和乙腈（如图1）。乙醇和乙腈作为提取溶剂时各化合物的回收率比较接近，但采用乙醇提取样品时，提取液经水稀释后产生浑浊现象，导致过膜困难。同样的现象也存在于啫喱基质中。因此，最终采用乙腈作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对膏霜基质中6种化合物回收率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on recoveries of 6 compounds in cream sample

2.1.2 提取溶剂中甲酸含量的影响6 种待测化合物的结构各不相同，酸碱性差别较大，为获得更好的提取效果，考察了向提取溶剂中加入不同含量甲酸对回收率的影响。结果表明，甲酸对化妆品中氨基比林的回收率影响较大。如图2A 所示，不加甲酸时，在膏霜、面膜、啫喱和喷雾4种基质中氨基比林的回收率为83.9%~91.5%，加入的甲酸含量越高，氨基比林的回收率越低。这可能是由于氨基比林为碱性化合物，甲酸的存在导致氨基比林离子化，在有机相中的分配减少，因此提取效率降低。其他5种化合物的回收率受甲酸含量的影响不大。图2B 为不同甲酸含量（0、0.2%、0.4%、0.6%）时5 种化合物回收率的平均值。除保泰松在面膜中的平均回收率为77.4%外，4种基质中其余5种化合物的平均回收率为97.9%~103%，标准偏差范围较小，说明甲酸含量对其余5种化合物的回收率影响不大。因此，为使6种化合物均能获得较好的回收率，选择不加甲酸的纯乙腈作为提取溶剂。

图2 提取溶剂中甲酸（FA）含量对氨基比林（A）和其它5种化合物（B）平均回收率的影响Fig.2 Effect of formic acid（FA）in extraction solvent on the recoveries of aminopyrine（A）and other 5 compounds（B）

2.1.3 提取方式的影响对化妆品进行液液萃取（LL）时，基质的充分分散有利于目标化合物的充分提取［16］。向化妆品加入少量饱和氯化钠，有利于胶束破乳，促进基质分散，同时可促进水相与乙腈之间分层。在加标水平为25 μg/L，提取溶剂体积为10 mL 时，考察了提取方式对加标回收率的影响。提取方式如下：一种是直接采用10 mL 乙腈进行一步提取（记为LL-1）；另一种是将提取溶剂分为2 次，每次5 mL 进行分步提取（记为LL-2）。4 种基质中6 种化合物采用不同提取方式的回收率见表2。由表2可知，相比一步提取，采用分步提取能获得更高的回收率。因此，最终采用10 mL乙腈分步提取方式进行样品前处理。

表2 6种化合物在一步提取（LL-1）和分步提取（LL-2）时的加标回收率（%）Table 2 Recoveries of six compounds with one step extraction（LL-1）and step by step extraction（LL-2）（%）

2.1.4 超声提取时间的影响在加标浓度为25 μg/L时，考察了超声时间对6 种化合物回收率的影响。如图3 所示，膏霜基质中保泰松的回收率受超声时间的影响较大，超声5 min 时的回收率最高，此后随着超声时间的延长，回收率显著下降。氨基比林的回收率也从92.2%降至78.0%，其他化合物的回收率随超声时间的延长而略有降低。面膜、啫喱和喷雾3种基质中，6种化合物的回收率受超声时间的影响不大，且均能达到80%以上。因此，选择最佳超声提取时间为5 min。

图3 超声时间对膏霜化妆品中6种化合物加标回收率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the recoveries of six compounds in cream

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择根据6种化合物的结构特点，采用混合标准溶液（10 μg/L）比较了BEH Shield RP18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、CORTECS C8（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm）和BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）3 种色谱柱的分离效果。结果表明，采用前两种色谱柱时，大部分化合物出现峰拖尾、峰形差等现象。而采用BEH C18柱时，6种化合物的保留时间有所区分，分离度较好，且能够获得较好的峰形。因此，最终采用BEH C18柱进行实验。

2.2.2 流动相的优化比较了甲醇-水和乙腈-水2 种流动相体系对6 种化合物分离效果的影响，结果表明2 种流动相对分离效果的影响不大。考虑到提取溶剂为乙腈，因此流动相采用乙腈-水体系。考察了甲酸、甲酸铵和乙酸铵3 种流动相添加剂对分离效果的影响。结果显示，在相同的梯度洗脱条件下，采用甲酸为流动相添加剂时保泰松的峰分叉严重，氨基比林的峰形较差；采用甲酸铵时，大部分化合物不出峰；以5 mmol/L 乙酸铵为添加剂时，6 种化合物均能获得较好的峰形和分离效果。这可能是由于乙酸铵体系可以改善含碱性基团化合物的峰形。因此，选择最佳流动相为含5 mmol/L 乙酸铵的乙腈和水。

2.2.3 进样溶剂的优化由于提取溶剂为纯乙腈，而初始流动相中含有大量水，流动相的洗脱能力弱于样品溶剂，导致色谱分离过程中溶剂效应显著［17-18］，6种化合物的峰形展宽严重。为克服溶剂效应，采用稀释剂对样品提取液进行稀释后再进样。以6 种化合物混合标准溶液（10 μg/L）为研究对象，考察了进样溶剂中乙腈比例分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%时对分离效果的影响。结果显示，采用30%~60%乙腈作为进样溶剂，6 种化合物的色谱峰均峰形尖锐，峰面积相差不大，但乙腈比例为50%时能够获得更大的峰面积。继续增大乙腈的比例，6 种化合物的保留时间均缩短，但峰形变差。因此，进样溶剂中最佳乙腈比例为50%。

2.3 质谱条件的优化

采用合适质量浓度的标准品溶液，在MS Only模式下，通过针泵注射将单标溶液进入质谱，调整质谱条件获得各化合物的母离子信息。将母离子打碎，寻找合适的特征子离子，再通过优化碰撞能、去簇电压等条件，得到各化合物的特征碎片离子及相应的质谱条件。最终，在正离子模式及MRM模式下对6种化合物的混合标准溶液进行扫描，能获得稳定的母离子和子离子。最佳实验条件下，6种化合物（质量浓度为50 μg/L）的提取离子色谱图如图4所示。

图4 6种化合物的提取离子色谱图（50 μg/L）Fig.4 Extract ion chromatograms of 6 compounds（50 μg/L）

2.4 基质效应

采用基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线，以两者斜率之比考察了方法的基质效应。比值越接近1，说明基质效应越小。结果表明，氯苯那敏在4种基质中的基质效应为150%左右，说明存在基质增强效应，其它5 种化合物在4 种基质中的基质效应为30.5%~50.1%，说明存在基质抑制效应。克服基质效应常用的方法有采用同位素内标、改进色谱分离、采用基质匹配标准物质进行校正等［19］。其中，采用基质匹配标准曲线进行校正的效果良好，且具有廉价、操作简便的特点［20］。因此，实验分别选用膏霜、面膜、啫喱和喷雾作为4种代表性基质，采用基质加标法定量，以消除基质效应的影响。

2.5 方法学评价

2.5.1 线性关系与检出限分别采用膏霜、面膜、啫喱和喷雾样品为空白基质，配制基质匹配标准溶液，采用本方法进行前处理和测定，以6 种化合物定量子离子的峰面积对相应的质量浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。结果表明，6种化合物的线性范围为5~200 μg/L，相关系数（r）均大于0.99。分别以3 倍信噪比和10 倍信噪比计算检出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），6 种化合物的LOD 均为0.15 μg/g，LOQ 均为0.50 μg/g（见表3）。该方法适用于膏霜、面膜、啫喱和喷雾类化妆品中6种化合物的同时测定。

表3 6种化合物在不同基质中的线性范围、相关系数、检出限和定量下限Table 3 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of 6 compounds in different matrix

2.5.2 精密度采用上述4种基质的空白加标样品，在相同条件下平行处理6份并采用本方法进行测定，以测定结果的相对标准偏差（RSD）评估方法的日内精密度。在相同条件下连续测定3 d，计算得到方法的日间精密度（见表4）。结果显示，该方法在处理不同基质类型的化妆品时，日内RSD 均不大于7.9%，日间RSD均不大于9.7%，说明方法的精密度良好。

表4 不同基质中6种化合物的精密度（%）Table 4 Precisions of 6 compounds in different matrix（%）

2.5.3 回收率为验证方法准确度，在膏霜、面膜、啫喱和喷雾4种空白样品中进行3个浓度水平的加标回收实验，每个浓度水平平行6 份，计算平均回收率和RSD（见表5）。结果表明，6 种化合物在4 种基质中的回收率为75.0%~120%，RSD 为0.72%~8.6%。该方法灵敏、准确、有效，能够用于多种类型化妆品中6种镇痛类药物的同时测定。