一步水热法制备氮掺杂碳点用于Fe3+检测及细胞成像

齐海燕，黄德敏，衣同辉，刘立琨，刘春彤

（1.齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院 科研处，黑龙江 齐齐哈尔 161000；3.齐齐哈尔医学院 医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；4.齐齐哈尔大学黑龙江省工业大麻加工技术创新中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

铁（Fe）作为生物体不可缺少的痕量金属元素之一，在氧摄取、氧代谢和电子转移等过程中发挥着重要作用，Fe 缺乏或过量均会导致疾病的发生。Fe 缺乏会引起贫血症，Fe 超标则会引起胰腺、心脏、肺部等功能器官障碍。有研究表明，阿尔兹海默疾病和帕金森症与Fe 有密切关系［1］。美国环境保护署（UEPA）和世界卫生组织（WHO）规定饮用水中Fe含量不得超过5 μmol/L［2］，故准确、定量检测Fe3+对环境保护和人类健康具有重要意义。

目前，已有多种方法可以实现金属离子的检测，如原子吸收光谱法［3］、电化学法［4］、电感耦合等离子体质谱法［5］等。虽然这些方法具有较高的灵敏度，但其操作较复杂、耗时，测试成本高，且选择性和稳定性差，样品制备繁杂。荧光传感分析法是利用被测离子与荧光传感器接触后发生荧光增强、猝灭或波长改变进行检测的一种分析方法，具有操作简单、分析迅速，稳定性和选择性较高等优点，并且样品前处理简单、测试响应时间短，已受到越来越多的关注。

碳点是一种具有荧光特性的碳基纳米颗粒，光学性能优异，稳定性较好，并且具有合成简便［6］、生物毒性低［7］、生物相容性好［8］、水溶性好［9］、易于表面修饰和复合［10］等优点，被广泛用于生物体内载药治疗［11-13］、生物成像［14-15］、分析检测［16-21］、能源转化［22］等领域。由于碳点表面含有丰富的羧基、羟基、氨基等基团，赋予了其在分析检测领域的众多优异性能。碳点可通过静电作用力、电子或能量转移及共价键等作用，或是表面改性，实现生物分子、离子、微生物、药物分子等的特异性检测。多种物质（如金属离子、阴离子、糖类、黄酮类等）对碳点的荧光强度有明显的猝灭作用，因此可以碳点作为荧光探针对其进行检测。现有的荧光碳点虽可灵敏检测Fe3+，但存在荧光量子产率不高、检出限不够低等问题［23］，因此制备一种荧光产率高且能灵敏检测Fe3+的荧光碳点具有重要意义。

氨基酸结构中具有氨基和羧基，作为碳源可在碳点制备过程中实现氮原子掺杂，提升荧光量子产率。氨基酸作为一种生物分子，以其为前驱体所制备的碳点具有更好的生物相容性，可用于细胞标记或细胞成像。本研究以人体必需氨基酸色氨酸和苏氨酸为碳源，采用一步水热法合成了氮掺杂碳点（N-CDs），该碳点水溶性好、荧光量子产率高、生物相容性好、毒性低，对Fe3+有较好的选择性和灵敏度，可用于实际生活饮用水中Fe3+的检测。同时进行了碳点的细胞毒性和细胞成像研究。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

色氨酸、苏氨酸（天津市光复精细化工研究所）；硫酸奎宁（北京伊诺科技有限公司）；溴化钾、CuSO4、MnSO4、NiSO4、SrCl2（天津科密欧化学试剂开发中心）；盐酸、HgCl2、CoCl2、SnCl2、Al2（SO4）3、PbSO4、CdSO4、HCl、NaOH、锡（北京化工厂）；硫酸（吉林省高端化学工业有限责任公司）；FeNH4（SO4）2·12H2O、Na2CO3（西安化学试剂厂）；Zn粉（中国医药（集团）上海化学试剂公司）；KCl、CaCl2、NaNO2、Zn（NO3）2（天津市化学试剂一厂）；MgCl2、NaCl、NaF（天津市凯通化学试剂有限公司）；H2O2（天津市大茂化学试剂厂）；NaClO（天津市天力化学试剂有限公司）。以上试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

人正常肝细胞株HL-7702（中国科学院细胞库）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖培养基（美国Sigma-Aldrich 公司）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（北京索莱宝科技有限公司）；CCK-8试剂盒和PBS缓冲液（安徽兰杰柯科技有限公司）；细胞培养瓶（美国康宁生命科学有限公司）；玻底培养皿（安徽兰杰柯科技有限公司）。

岛津TU-1901 紫外可见光谱仪、GMB-2 净水器（北京普析通用仪器有限公司）；岛津RF4301-PC 荧光分光光度计（日本岛津责任有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪（美国尼高力公司）；ESCALAB250Xi 型X 射线光电子能谱仪（XPS）、CO2细胞培养箱（美国Thermo 公司）；德国D8-FOCUS型X 射线粉末衍射仪（XRD，德国BRUKER-AXS 公司）；JEM-2100F 型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；AMR-100全自动酶标分析仪（杭州奥盛仪器有限公司）；Axio Observer荧光倒置显微镜（德国ZEISS公司）；K78水热反应釜（上海巩义市英峪实验仪器中心）；移液枪（德拉贡实验仪器（美国）有限公司）；实验室pH计PE20（梅特托利多仪器（上海）有限公司）；WD-9403E紫外灯（北京市六一仪器厂）。

1.2 碳点的制备

以色氨酸和苏氨酸为碳源，采用水热法制备碳点。分别称取0.511 0 g 色氨酸和0.894 0 g 苏氨酸（摩尔比1∶3），溶于50 mL pH 2.0 的水溶液中，转入5 个30 mL 的聚四氟乙烯反应釜中，置于烘箱于180 ℃反应8 h，待其自然冷却至室温后得到黄棕色的碳点水溶液。将该碳点溶液经5 000 r/min 离心10 min，除去大颗粒杂质，再通过分子量为500 D的透析袋连续透析65 h，得到粉红色碳点水溶液，经冷冻干燥后得到浅黄色碳点粉末N-CDs。

1.3 Fe3+离子检测

以FeNH（4SO4）·212H2O 为离子源，其溶解后电离产生的NH4+能很好地抑制Fe3+的水解。称取FeNH4（SO4）·212H2O 固体配制成0.01 mol/L 的储备液，取少量逐级稀释至所需浓度。依次向2 mL 质量浓度为0.25 μg/mL的碳点溶液中加入3 μL不同浓度的Fe3+，使Fe3+的终浓度分别为0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L，共同孵育60 s后，以370 nm激发，记录荧光发射光谱，绘制线性曲线。

1.4 选择性实验

以各金属离子（Fe3+、Cu2+、K+、Mn2+、Mg2+、Sr2+、Na+、Co2+、Cd2+、Ca2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+、Al3+和Sn2+）和氧化性、还原性离子（Cl-、NO−2、F-、NO−3、ClO-、CO）的可溶性盐以及H2O2配制浓度均为0.01 mol/L 的检测溶液。向2 mL质量浓度为0.25 μg/mL的碳点溶液中加入金属离子溶液，使其终浓度为0.5 mmol/L，共同孵育60 s后，以370 nm激发，记录荧光发射光谱。

1.5 生活饮用水中Fe3+的测试

以本地市售瓶装饮用矿泉水为实际样品进行检测，直接使用。将4 mL 矿泉水与10 μL 质量浓度为0.1 mg/mL 的碳点溶液共同孵育60 s，记录370 nm 激发波长处的荧光强度，将该值带入“1.3”获得的线性方程，得到瓶装饮用水中Fe3+的浓度。

1.6 细胞毒性及细胞成像

HL-7702 细胞毒性实验：人正常肝细胞株HL-7702 采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时用胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，用10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基吹打成单细胞悬液后，按照0.5×104/孔的密度将细胞接种于96 孔板中，置37 ℃继续培养。显微镜下观察，待细胞铺满后进行实验。

碳点用DMEM 高糖培养基溶解并无菌过滤后，以DMEM 培养基梯度稀释为6 个质量浓度（100、200、300、400、500、600 μg/mL）；按100 μL/孔加入HL-7702 细胞中，每组设置4 个复孔，对照组加入相同体积DMEM 高糖培养基。置于37 ℃孵育24 h后，按20 μL/孔加入CCK-8检测试剂，孵育1 h后于450 nm测定吸光度。进行细胞存活率测定：存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%［24］。

HL-7702细胞成像实验：按细胞毒性实验相同方式培养HL-7702细胞，待细胞生长至对数生长期时按照1×106个/皿接种于玻底培养皿中，待细胞增长至培养皿的80%底面积左右时，按1 mL/孔加入质量浓度为300 μg/mL的碳点溶液。培养24 h后，以磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤2次去除残留碳点，然后在荧光显微镜下观察细胞形态。加入终质量浓度为10、20、40 μg/mL的Fe3+继续孵育5 min后，观察Fe3+的猝灭效果。

2 结果与讨论

2.1 碳点结构表征

N-CDs 的透射电镜表征结果显示，碳点呈近似球形（图1A），高分辨率透射电镜图（图1B）显示其晶格间距为0.21 nm，粒径分布在3～5 nm之间，平均粒径为4.1 nm（图1A插图）。N-CDs的XRD谱如图1C所示，在23°附近有一个明显的衍射峰，对应石墨结构碳的（002）晶面，证明所制备的碳点具有与石墨类似的结构［22］。图1D 为碳点的红外吸收光谱，由图可知，3 410 cm-1处为—OH 的伸缩振动；2 930 cm-1和2 890 cm-1处的吸收峰为饱和C—H 键的伸缩振动，1 630 cm-1处为N—H 的变形振动，1 513～1 410 cm-1之间的3 个峰为吲哚环的吸收峰，1 335～1 200 cm-1处的弱吸收带为N—H 弯曲振动与C—N伸缩振动偶合形成的酰胺带，1 112 cm-1处是C—O的伸缩振动峰。

图1 N-CDs的高分辨率透射电镜图（A）、晶格条纹（B）、X射线衍射光谱（C）和FTIR谱图（D）Fig.1 High-resolution TEM（A），lattice fringes（B），XRD（C）and Fourier transform infrared（FTIR）spectrum（D）of N-CDs

碳点的XPS表征结果见图2A，全扫描谱中，532.2、399.8、285.0 eV处分别为O1s、N1s和C1s的特征峰，说明该碳点主要由C、N、O 3种元素组成；C、N和O的原子比为70.8%、8.4%和20.8%。对C1s的特征峰进行分解，得到284.5、286.4、288.5 eV 3个峰（图2B），分别与C—C/C===== C、C—O、C===== O官能团对应。N1s的分解峰在399.8、402.2 eV处（图2C），表明氮元素主要以C—N键和N—H键的形式存在。在530.9、532.6 eV处的O1s峰（图2D）分别归属于C===== O和O—C键［25-27］。结合红外吸收光谱，可以证明碳点表面含有—OH、—COOH、—NH2、吲哚等结构，因此制备的碳点易于修饰且具有良好的水溶性。

图2 N-CDs的XPS全谱图（A）与C1s（B）、N1s（C）、O1s（D）的高分辨率XPS谱图Fig.2 XPS（A）and C1s（B），N1s（C），O1s（D）high-resolution XPS patterns of N-CDs

2.2 碳点的光学性质

通过测定得到所制备碳点的荧光量子产率为87.09%。N-CDs 在水溶液中的紫外吸收光谱如图3A所示，在278 nm 处的强吸收峰为B 吸收带（π→π*），表明碳点具有C===== C 共轭结构；在360 nm 处的弱吸收峰为R 吸收带（n→π*），说明碳点结构中具有n电子的生色基团（羰基）且存在与其共轭的结构。图3A 插图为N-CDs 水溶液的图片，其在自然光下呈淡粉色，在365 nm 紫外灯照射下则发出蓝色荧光。由图3B 可知，N-CDs 的最佳激发波长为370 nm，发射峰位置为440 nm，后续实验均在最佳激发波长下进行。图3C 显示，激发波长在320～400 nm 内改变时，荧光强度发生变化，但其发射峰位置未发生变化，与文献［28］的结果对比可知此碳点无激发波长依赖性。

图3 N-CDs的紫外吸收光谱（A）、荧光光谱（B）和荧光发射光谱（C）Fig.3 UV spectra（A），fluorescence spectra（B）and fluorescence emission spectra（C）of N-CDs

2.2.1 离子强度的影响为了研究离子强度对N-CDs 荧光强度的影响，在3 mL 不同浓度的NaCl（pH 7.0）溶液中加入3 μL 质量浓度为0.25 μg/mL 的碳点溶液，使碳点的终质量浓度为0.083 3 μg/mL，记录荧光强度。结果发现随着NaCl浓度的增加，碳点的荧光强度未发生显著变化，表明制备的碳点具有较好的耐盐性。进一步考察了碳点的光学稳定性，取2 μL质量浓度为0.25 μg/mL的碳点溶液，加入2 mL（pH 7.0）超纯水中，使碳点的终质量浓度为0.125 μg/mL。结果发现，N-CDs 的荧光强度在一周之内基本不变，证明该碳点有较好的光学稳定性。

2.2.2 pH 值的影响将碳点用于实际检测时，环境中的pH 值将会对碳点产生影响，因此需对实验环境的pH值进行优化以提高检测灵敏度。在3 mL pH 值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 的一系列盐酸溶液中，以及pH值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0的氢氧化钠溶液中，加入3 μL 质量浓度为0.125 μg/mL的碳点溶液，使其终质量浓度为0.041 7 μg/mL，记录荧光强度，结果如图4 所示。随着酸性增强，碳点的荧光强度有所减弱；随着碱性增强，荧光则显著猝灭，表明该碳点适用于弱酸和中性条件。

图4 pH值对N-CDs荧光强度的影响Fig.4 Effect of pH value on fluorescence intensity of N-CDs

2.3 N-CDs检测Fe3+离子的原理

根据FTIR 数据可知，N-CDs 表面存在羧基、氨基或羟基等有机基团，这些基团增强了N-CDs 对Fe3+的亲和性。Fe3+有3 个正电荷，有利于光诱导电子从N-CDs 转移到Fe3+的d 轨道，与Fe3+选择性配位形成配位键（图5），形成的配合物可以改变N-CDs的电子结构，影响激发电子的分布，并通过有效的光电子或能量转移加速激发电子的非辐射重组，进一步导致荧光猝灭［29-31］。

图5 N-CDs检测Fe3+离子的猝灭原理图Fig.5 Schematic of quenching mechanism of N-CDs for Fe3+ion detection

2.4 线性关系及检出限

考察了N-CDs 对Fe3+的响应情况，结果发现，随着铁离子浓度的增加，碳点荧光强度逐渐降低，这是因为Fe3+离子浓度越大，越容易与碳点表面的含氧官能团进行配位，荧光猝灭越明显。分别以I0和I表示Fe3+加入前后N-CDs的荧光强度，以I0/I对铁离子浓度作图，结果显示，Fe3+浓度在1～20 μmol/L和20～50 μmol/L 范围内与I0/I具有良好的线性关系，其线性方程分别为I0/I=0.001 09［Fe3+］+1.011 7、I0/I =0.003 81［Fe3+］+0.954 9，相关系数分别为r2=0.999 4、r2=0.997 3。对Fe3+的检出限（S/N=3）为0.36 μmol/L。与文献报道的Fe3+的检测方法相比（表1），本方法具有较低的检出限。

表1 不同荧光检测法对Fe3+检测性能的比较Table 1 Comparison of performance of different fluorescence methods for detection of Fe3+

2.5 选择性

进一步考察了N-CDs 对Fe3+的选择性，在N-CDs溶液中分别加入相同浓度的金属离子以及具有氧化性和还原性的物质。结果显示N-CDs 对Fe3+的响应最为显著（图6），证明该碳点对Fe3+具有良好的选择性，可用于实际样品中Fe3+的检测。

图6 N-CDs对Fe3+的选择性Fig.6 Selectivity of N-CDs to Fe3+

2.6 实际样品测定

为评估该方法的可行性，将N-CDs用于生活饮用水中铁离子的检测，水样为当地超市售卖的某瓶装饮用矿泉水。检测发现该碳点对该瓶装矿泉水无明显响应，即未检出Fe3+。利用原子吸收光谱法对同一样品进行检测，同样未检测到铁离子。为了进一步验证本方法的准确性，向待测水样中加入不同浓度（5、10、15 μmol/L）的铁离子标准溶液进行加标回收实验，结果如表2所示。瓶装矿泉水中Fe3+的回收率为97.3%～107%，相对标准偏差（RSD）不大于2.0%。国标生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）中的铁含量为0.3 mg/L（即5 μmol/L）［37］，高于本方法的检出限，证明该方法可以用于生活饮用水中铁离子浓度的检测。

表2 生活饮用水中Fe3+的加标回收率Table 2 Recoveries of Fe3+spiked in drinking water

2.7 细胞毒性及细胞成像

荧光碳点由于具有优异的光学性能、较低的毒性以及良好的生物相容性，被广泛应用于荧光探针领域。N-CDs 具有高的荧光量子产率，适合作为荧光探针标记HL-7702 细胞。材料能否作为生物探针的一个重要指标是细胞毒性的高低。采用CCK-8 比色法测试碳点的生物毒性。如图7A 所示，将HL-7702 细胞分别在不同质量浓度（100、200、300、400、500、600 μg/mL）的碳点中培养24 h，发现即使碳点质量浓度为600 μg/mL，细胞活性仍高达94.46%。表明该碳点具有相当低的细胞毒性，是作为荧光探针标记细胞进行细胞成像实验的理想材料，且其最佳质量浓度为300 μg/mL（图7A）。

将碳点与HL-7702 细胞共同孵育后，通过荧光倒置显微镜观察，发现HL-7702 细胞形态无明显变化（图7B），说明该碳点对细胞没有损伤，具有良好的生物相容性；在365 nm条件下观察，发现细胞膜和细胞质均有强烈荧光（图7C），表明该碳点很容易进入细胞内部，有望运用于载药治疗领域［38］。该碳点能够特异性识别Fe3+，在细胞内与Fe3+共同孵育时，随着Fe3+浓度升高，荧光逐渐猝灭（图7D-F）。实验表明该碳点可用于细胞成像，且能实现活细胞内铁离子的可视化。

图7 N-CDs的细胞毒性（A），HL-7702细胞与300 μg/mL碳点孵育后的图像（B），HL-7702细胞与300 μg/mL碳点孵育后的荧光图像（C），HL-7702细胞与300 μg/mL碳点以及10 μg/mL（D）、20 μg/mL（E）、40 μg/mL（F）Fe3+共孵育的荧光图像Fig.7 Cytotoxicity of N-CDs（A），the image of HL-7702 cells incubated with 300 μg/mL carbon dots（B），the fluorescence image of HL-7702 cells incubated with 300 μg/mL carbon dots（C），the fluorescence images of HL-7702 cells incubated with 300 μg/mL carbon dots with 10 μg/mL（D），20 μg/mL（E），40 μg/mL（F）Fe3+

3 结 论

采用生物相容性优异的天然氨基酸分子色氨酸和苏氨酸作为前驱体，利用一步水热法制备了具有高荧光量子产率、光稳定性和耐盐性好的N 掺杂荧光碳点。基于碳点对Fe3+的高选择性猝灭响应，建立了铁离子的检测方法。该方法在1～20 μmol/L 和20～50 μmol/L 范围内具有良好的线性，检出限（S/N=3）为0.36 μmol/L。方法准确性高，可用于实际水样中铁离子的检测。该碳点细胞毒性低，已成功用于生物体外细胞成像且实现了细胞内Fe3+的可视化，为生物体内Fe3+可视化定量检测提供了一种可能的途径。