基于超高效液相色谱-高分辨质谱的非靶向代谢组学技术结合化学计量学对信阳茶树品种差异的研究

李淑芳，刘继红，尹海燕，刘冬梅，郭晓萌，杨亚琴，王会锋，于永杰

（1.河南省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，河南 郑州 450002；2.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004）

茶树（Camellia sinensis（L）O.Kamtze.）作为一种特色经济作物，在信阳地区农业中占据重要地位。信阳地属江北茶区，有10个县区产茶，茶园面积广阔。茶树品种是茶叶生产中最重要的生产资料，是茶产业可持续发展的物质基础。受原有茶园面临老化更新、新建茶园面积不断增大、采茶机械化需求等因素影响，选育与推广优良无性系茶树品种成为当前信阳地区茶产业发展的紧迫需求［1］。乌牛早、白毫早、舒茶早、平阳特早等茶树品种因具有出芽早、产量高，以及适制信阳毛尖等特点，近年来在信阳地区无性系茶园推广面积不断扩大［2］。研究这些品种在相同农艺措施下的成分差异，对于品种的选育推广与综合利用均具有积极意义。

目前已有不少关于信阳茶区不同茶树品种的比较研究，主要集中在依据茶叶中儿茶素、茶多酚、氨基酸、咖啡碱、叶绿素等少数主要成分的含量与感官鉴定相结合进行茶叶品质和适制性的评价与比较［3-6］。然而，茶叶中经分离鉴定的已知化合物有700 多种［7］，仅依赖主要成分和感官鉴定评价茶树品种的优劣，缺乏科学全面的量化依据和精确描述。因此，有待开展能够全面反映茶叶中化学物质信息的茶树品种差异评价方法的研究。

非靶向代谢组学通过分析尽可能多的代谢物，能够从整体上反映生物的状态。目前，代谢组学主要基于核磁共振和质谱分析平台并结合化学计量学进行代谢差异研究［7-9］。其中，超高效液相色谱联用高分辨质谱分析（UHPLC-HRMS）平台在非靶向代谢分析中扮演着重要角色。该平台通过高精度质量数、保留时间、二级质谱等作为定性判据，为分析海量代谢信息提供了高分辨工具平台。基于UHPLC-HRMS 的非靶向代谢组学技术为茶叶品种研究提供了新的解决方案［10-14］，如Chen 等［10］采用UPLC-QTOF/MS 及UPLC-QqQ MS 结合化学计量学方法对14 个武夷山岩茶品种进行代谢轮廓分析，完成49 种主要代谢物的相对定量，讨论了其在不同茶品种中的分布。Li 等［11］采用基于UHPLC-QTOF/MS 的非靶向代谢组学研究了13 个中国茶树品种的代谢物差异，将不同茶树品种分为绿茶适制性品种和兼具绿茶、黑茶适制性品种两类。Wang 等［13］采用UPLC-Q-TOF/MS 与化学计量学结合分析了信阳毛尖绿茶因品种、种植海拔及加工方式等因素造成的代谢物差异，研究发现茶树品种和种植海拔对代谢物差异影响显著，而机械或手工等加工方式无明显影响。

茶叶中初级代谢物及二级代谢物化学物质构成极为复杂，利用UHPLC-HRMS 对其分析面临如何高通量、智能化地提取与识别其中的化合物信息等实际难题［15］。于永杰课题组发展的自动化数据分析策略软件平台AntDAS［16］集总离子流峰（TIC）读取、提取离子色谱（EIC）提取、EIC 峰解析、化合物鉴定、多组样本批处理、化学计量学建模等于一体，能够实现复杂植物样品中UHPLC-HRMS 数据的自动化解析。本研究在该自动化数据分析平台的基础上，利用基于超高效液相色谱串联Q Exactive-Orbitrap 高分辨质谱的非靶向代谢组学技术，结合化学计量学方法，分析了信阳地区相同农艺措施下的乌牛早、舒茶早、白毫早、平阳特早、陕茶一号等5 个茶树品种鲜叶（一芽一叶）样本中的化学成分差异。使用层次聚类分析（HCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、热图分析等方法评价了不同茶树品种的化学物质基础差异。研究结果可为茶树品种的品质评价与选育推广提供理论指导。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000超高效液相色谱串联Q Exactive-Orbitrap 静电场轨道阱高分辨质谱联用仪（UHPLCHRMS，美国赛默飞世尔科技公司）；赛多利斯BS224S 电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；艾本森MixOne 漩涡振荡器（合肥艾本森科学仪器有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；艾本德5810 R 型台式高速大容量冷冻离心机（德国艾本德股份公司）；5 mL离心管（合肥白鲨生物科技有限公司），2 mL离心管（爱思进生物技术（杭州）有限公司）；Retsch MM400混合冷冻混合球磨仪（德国莱驰公司）。

甲醇（质谱级，德国默克股份两合公司）；乙腈（色谱纯，德国默克股份两合公司）；甲酸（98% ~100%，质谱级，德国默克股份两合公司）。高纯水通过Milli-Q净水系统获得。

1.2 样本采集与制备

乌牛早、舒茶早、白毫早、平阳特早、陕茶一号等茶树品种的一芽一叶鲜叶采摘于信阳市农业科学院五里店茶叶示范园（东经114°17′60″，北纬32°9′8″，海拔60 m），5个茶树品种的栽种时间、生长环境及管理措施一致。分别于2019 年4 月3 日（清明前）、2019 年4 月16 日（谷雨前）、2019 年5 月6 日（立夏）3 个时间采样，每次采样各品种的样品均设有3 个生物学重复。新鲜茶叶经液氮处理后使用Retsch MM400球磨仪磨碎，经低温冻干后研磨成粉并于-80 ℃环境避光保存备用。从45份茶叶粉末样本中各取出0.5 g混合均匀制备成质量控制样品（QC）。

1.3 样本分析

在张茜等［14］研究工作的基础上建立了基于UHPLC-Q Exactive 高分辨质谱数据依赖模式（DDA）的新鲜茶叶分析方法。

1.3.1 样本前处理精密称量茶叶样品60.0 mg，置于5 mL 离心管中，加入4.5 mL 甲醇-水（1∶9，体积比）混合提取溶剂，充分涡旋2 min 后，在室温下超声提取30 min，随后于4 500 r/min 下高速离心5 min。将上清液转移至2 mL EP管重复离心1次，在12 000 r/min下高速离心10 min。最后吸取EP管中上清液0.8 mL于进样色谱瓶中，待高分辨质谱上机分析。

1.3.2 UHPLC-HRMS仪器分析条件液相色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；进样体积为1 μL；流动相A：高纯水（含0.1%甲酸），流动相B：乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.2 mL/min，梯度洗脱程序：0 ~ 10 min，0% ~ 30% B；10~ 15 min，30%~90%B；15~17 min，90%~100%B；17~20 min，100%B；20.5~25.5 min，0%B。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源，选择正离子扫描模式（ESI+），喷雾电压为3 500 V，离子传输毛细管温度为320 ℃，鞘气（氮气）气体流量为30 arb，辅助气（氮气）气体流量为10 arb。采用FULL MS/DD-MS²（TOP4）模式完成数据采集。一级质谱分辨率为35 000 FWHM（半峰宽），自动增益控制（AGC）为5×106，最大注入时间为100 ms，扫描范围为120~1 000 Da；二级碎裂方式选择高能碰撞诱导裂解模式（HCD），碰撞能量为20 eV，分辨率为17 500 FWHM，自动增益控制（AGC）为5×106，最大注入时间为25 ms，隔离窗口为0.4 Da，动态排除时间为4.5 s。

1.4 UHPLC-HRMS数据分析

UHPLC-HRMS 原始数据采集通过Xcalibar（Thermo Fisher Scientific）获得。新鲜茶叶样品在ESI +模式下采用UHPLC-HRMS 代谢组学分析的典型TIC 图如图1 所示。将原始数据导入AntDAS 分析软件平台中，自动执行EIC 峰提取、峰对齐、化合物注册等步骤，获得化合物样本×峰面积的注册表，利用方差分析（ANOVA）筛查具有差异性的成分及其MS/MS 谱图，并与标准谱库比对实现化合物鉴别。利用差异性成分进行HCA、PLS-DA 及热图分析评价不同茶树品种的化学成分变化。本研究中，差异化合物筛选条件为p＜0.01，HCA 分析采用欧氏距离进行距离分析。上述数据分析均在AntDAS中完成。

图1 茶鲜叶在正离子模式下的总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram of a fresh tea leaves under the positive mode

2 结果与讨论

2.1 AntDAS平台中化合物色谱峰的自动化提取

将仪器采集的UHPLC-HRMS 原始数据直接导入AntDAS 进行色谱峰的自动化提取。以QC 样本为例，经AntDAS 解析后获得样本中EIC 峰为9 066 个。图2 给出了AntDAS 提取其中一个EIC（m/z291.085 5）下所有色谱峰的示例。经AntDAS 解析后，共提取出8 个色谱峰，包括2个信号强度较高的色谱峰（4号、6号）和6个强度较低的色谱峰（见图2A）。图2B 和2C 给出了强度较低的色谱峰的局部放大图。可见，AntDAS 能够实现化合物信息和仪器背景噪声的有效识别，完成EIC 中色谱峰的高质量提取。

图2 AntDAS提取EIC中色谱峰的示例Fig.2 IllustrationofEICpeakextractionintheAntDAS

2.2 不同品种茶鲜叶的HCA和PLS-DA分析

采用ANOVA 分析色谱峰注册表，最终获得不同品种茶树鲜叶样品中具有显著差异性的色谱峰17 691 个。以筛选出来的所有差异性色谱峰为基础，利用化学计量学方法HCA 和PLS-DA 对不同茶树品种的鲜叶样本进行分析，结果见图3。HCA 分析结果（图3A）表明，5个茶树品种能够各自聚成一类，其中，乌牛早、舒茶早、白毫早3 个品种更为相似。PLS-DA 分析给出了类似结果（图3B），样本在前两个隐变量的得分图显示乌牛早、舒茶早、白毫早3个品种较为接近，平阳特早、陕茶一号与其它品种存在明显不同。图3结果表明，在相同的生长环境和农艺措施下，5种茶树品种各具特色，不同茶树品种获得的新鲜茶叶存在明显差异。品种间的分析结果显示乌牛早、舒茶早、白毫早整体上更为接近，与平阳特早和陕茶一号存在较大差异。

图3 不同茶树品种的HCA（A）和PLS-DA（B）分析结果Fig.3 HCA（A）and PLS-DA（B）analysis results of different tea cultivars

2.3 不同品种茶鲜叶中差异性代谢物的鉴别

AntDAS对具有显著性差异的色谱峰进行碎片离子识别后，将解析得到化合物的一级、二级质谱与第三方公开的数据库（http：//prime. psc. riken. jp/compms/msdial/main. htmL）中的标准谱图进行逐一比对，从而实现化合物的鉴定。图4 以表儿茶素为例给出了本研究中差异代谢物的鉴别过程。经过AntDAS 解析后，获得具有差异性的EIC 峰如m/z139.038 5、291.085 2 等。AntDAS 对这些离子的EIC峰形（图4A）进行相似度计算后将其识别为可能来自同一个成分的碎片离子，并构建了化合物的一级、二级质谱谱图（图4B1、B2）。分别将一级、二级质谱谱图与化合物数据库中的谱图进行比对，发现表儿茶素的质谱相似度最高（图4B1、B2）。基于上述化合物鉴别流程，本研究鉴定出33种差异性化合物（见表1），包括可可碱1种生物碱类物质，表儿茶素、表没食子儿茶素、（-）-表阿夫儿茶精3种儿茶素类物质，绿原酸、没食子酸等4种酚酸类物质，茶氨酸、精氨酸、L-苯丙氨酸等5种氨基酸类物质，腺苷酸、5-脱氧-5-甲硫腺苷等6种核苷类物质，牡荆素、柚皮苷、芦丁等14种黄酮类物质。

图4 利用AntDAS进行代谢物鉴别过程示例Fig.4 Illustration of the compound identification process by AntDAS

表1 AntDAS鉴定出的33种差异性代谢物Table1 The identified 33 significant difference compounds by AntDAS

（续表1）

2.4 不同品种茶鲜叶的热图分析

根据33 种差异性化合物的相对丰度进行热图分析（见图5）。结果显示，在相同的生长环境和农艺措施下，不同茶树品种的代谢物含量存在明显差异，各具特色。其中，乌牛早中表没食子儿茶素以及异槲皮素、芦丁、香橙素、柚皮素、柚皮苷、槲皮素-3-D-木糖苷、金丝桃苷等8 种黄酮类化合物的含量较高；舒茶早中表儿茶素、（-）-表阿夫儿茶精、酪氨酸、甲硫腺苷及S-腺苷高半胱氨酸等化合物的含量较高；白毫早中对羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、色氨酸等化合物的含量较高；平阳特早中茶氨酸、精氨酸、S-腺苷蛋氨酸、牡荆素等化合物的含量较高；陕茶一号中可可碱、绿原酸、没食子酸、紫云英苷、烟花苷、棉花皮苷等化合物的含量较高。整体上，乌牛早品种中黄酮类含量高，舒茶早品种中儿茶素及核苷含量高，白毫早品种中酚酸类含量高，陕茶一号品种中生物碱、酚酸、黄酮类含量高。本研究对差异化合物含量的比较中，部分结果与文献报道一致，如Wang等［12］指出不同品种茶鲜叶中不仅儿茶素有明显差异，其他如氨基酸、黄酮及其糖苷、酚酸及生物碱等不突出的植物化学物质亦有明显不同；王子浩等［5］对9个茶树加工白茶的研究指出，舒茶早中儿茶素的含量高于白毫早、乌牛早、平阳特早；刘冬梅等［6］对4个信阳主栽茶树品种的适制性研究指出乌牛早中茶氨酸的含量低于白毫早。

图5 信阳地区5个茶树品种差异性化合物的热图分析Fig.5 Heatmap of significant difference compounds in five tea cultivars planted in Xinyang the number denoted was the same as that in Table 1

3 结 论

本文采用基于UHPLC-HRMS 的非靶向代谢组学技术对信阳地区5 个茶树品种鲜叶样品中的差异性化合物进行了研究。将基于UHPLC-HRMS 的非靶向代谢组学技术与化学计量学数据自动化解析软件平台相结合，对茶鲜叶样品中的化合物信息进行剖析，经与标准数据库匹配后最终鉴别出不同茶树品种中具有显著性差异的33种化合物，包括表儿茶素、茶氨酸、可可碱、绿原酸、腺嘌呤、金丝桃苷等。采用化学计量学方法进行聚类分析和热图分析，评价了在相同的生长环境和农艺措施下不同茶树品种的化学物质基础差别。本研究为不同茶树品种的差异性分析提供了一种新的研究策略，有望为茶叶产区品种选育与推广研究提供理论支撑。