基于数据库筛选补中益气汤中7种黄酮类成分及其含量分析

曹礼慧 徐汉明 袁中文 陈朋 冯森玲

摘要：目的 筛选补中益气汤治疗子宫脱垂7种黄酮类成分及其含量分析。方法 运用TCMSP数据库筛选补中益气汤治疗子宫脱垂的关键化合物，采用HPLC法分析关键化合物的含量，Agilent SB-C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），流动相为色谱乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱，进样量10μL，流速为1.0 mL/min，检测波长：254 nm，柱温为30℃。结果 通过数据库筛选出7种黄酮类成分，包括槲皮素、山柰酚、柚皮素、异鼠李素、刺芒柄花素、川陈皮素、毛蕊异黄酮。结论 建立HPLC法测定补中益气汤治疗子宫脱垂的7种黄酮类成分，该含量测定方法稳定、可靠、准确，可用于补中益气汤质量控制并指导临床用药。

关键词：补中益气汤;TCMSP数据库;高效液相色谱法;黄酮类成分;含量分析

中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）02-0071-04

Content Analysis of Seven Flavonoids Compounds in Buzhong YiqiDecoction Based on Database

CAO Li-hui1， XU Han-ming2， YUAN Zhong-wen1， CHEN Peng3， FENG Sen-ling1

（1.The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University/Guangdong Provincial Key Laboratoryof Obstetrics Major Diseases， Guangzhou 510150， China;2. Shenzhen Hospital of Beijing University， Shenzhen 518033， China; 3. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China）

【Abstract】Objective： To analyze the content of seven flavonoids compounds in Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse patients. Methods： The key compounds of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse were screened by using TCMSP database， and the content of key compounds was analyzed by HPLC. Agilent SB-C18 column was 250mm×4.6mm， 5μm， and the mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution gradient elution. The injection volume was 10 μL and the flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. Results： Seven flavonoids were screened from the database， including quercetin， kaempferol， naringenin， isorhamnetin， formononetin， nobiletin and calycosin. Conclusion： A HPLC method was established for the determination of seven flavonoids in Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse. The content determination method is stable， reliable and accurate， and can be used for quality control of Buzhong Yiqi Decoction and guide clinical medication.

【Key words】Buzhong Yiqi Decoction; TCMSP Database; High Performance Liquid Chromatography; Flavonoids; Content Analysis

補中益气汤[1]来源于名医李东恒《脾胃论》，主治脾胃气虚证、气虚下陷证和气虚发热证。子宫脱垂[2]是盆腔脏器脱垂的主要表现形式，其严重影响了患者的正常生活，目前发病机制仍不清楚，只能通过对症治疗减轻患者的不适，无法彻底根治[3-4]。文献研究表明[5-6]，补中益气汤可能是通过提高TGFβ-3表达或通过抑制miR-30d表达，增加盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带胶原蛋白的合成，从而改善盆腔脏器脱垂情况。也有文献通过临床研究发现[7-9]，试验组服用补中益气汤后子宫脱垂的临床症状较对照组明显改善。补中益气汤作为复方，具有化学成分复杂，使得治疗子宫脱垂的药代动力学研究中的目标化合物不明确[10]。研究通过TCMSP数据库筛选补中益气汤治疗子宫脱垂的关键化合物，继而建立高效液相色谱法分析含量，此方法的建立为补中益气汤治疗子宫脱垂关键化合物的质量控制提供有效依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司;FR224CN型电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司;KQ-300E型超声机，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 样品与试剂 槲皮素（批号：100081-200406，中国生物制品检定所）、山柰酚（批号：S-014-121218，天津市科曼思特医药科技发展有限公司）、柚皮素（批号：L09834，大连美仑生物技术有限公司）、异鼠李素（批号：110860-201611，中国食品药品检定研究院）、刺芒柄花素（批号：N0301AS，大连美仑生物技术有限公司）、川陈皮素（批号：B20199，上海源叶生物科技有限公司）、毛蕊异黄酮（批号：D0806AS，大连美仑生物技术有限公司）;色谱级乙腈（Sigma 公司），超纯水（自制），其余试剂均为分析纯。

补中益气配方颗粒（批号：黄芪20032711、人参20009131、白术20020101、炙甘草20031601、当归20028041、陈皮20017121、升麻20039941、北柴胡20033021，北京康仁堂药业有限公司）。

2 方法与结果

2.1 关键化合物的筛选 利用TCMSP数据库，以“黄芪”、“人参”、“甘草”、“白術”、“升麻”、“柴胡”、“陈皮”、“当归”为关键词，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件，对化合物进行筛选，根据UniProt数据库对靶点进行标准化处理，将靶点转化为对应基因，限定物种为“Homo Sapiens”获得补中益气汤活性成分及对应靶点，剔除重复及与UniProt匹配后补中益气汤共117个靶点;通过GeneCards数据库，以“uterine prolapse”作为关键词检索，获取子宫脱垂靶点667个，其中与补中益气汤的交集靶点共37个。使用Cytoscape软件构建“中药-化合物-交集靶点”网络，其中度值较高的化合物有槲皮素、山柰酚、柚皮素、异鼠李素、刺芒柄花素、川陈皮素、毛蕊异黄酮等，可能是补中益气汤治疗子宫脱垂的关键化合物，见表1。

2.2 含量分析方法与结果

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），柱温为30℃，进样量10μL，流速为1.0 mL/min，检测波长：254 nm下测定，流动相为色谱乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱条件：0～10 min，10%乙腈;10～30 min，10%～80%乙腈;30～31 min，80%～10%乙腈;31～45 min，10%乙腈。见表2。

2.2.2 对照品溶液的制备 取柚皮素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、刺芒柄花素、川陈皮素、毛蕊异黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度约为0.5mg/mL溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 取补中益气配方颗粒（黄芪6 g，人参1.8 g，白术1.8 g，炙甘草3 g，当归1.2 g，陈皮0.6 g，升麻0.6 g，柴胡0.6 g，合计15.6 g），研细，取0.5 g。精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，超声处理（功率300w，频率40kHZ）50min，放冷，用70%乙醇定容至50 mL，摇匀，静置，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 按照“2.2.1”项下色谱条件，分别向HPLC中注入混合对照品溶液5、10、15、20、25μL，在254 nm处测定峰面积值，并以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得7种黄酮类化合物的线性回归方程分别为：Y=612.334X+0.0574，R2=0.9926，表明柚皮素在0.0015-1.1452 mg/mL与峰面积呈良好线性关系;Y=583.690X+0.0641，R2=0.9938，表明槲皮素在0.0014-1.2471 mg/mL与峰面积呈良好线性关系;Y=468.614X+0.0741，R2=0.9974，表明山柰酚在0.0031-1.1479 mg/mL与峰面积呈良好线性关系;Y=502.387X+0.0063，R2=0.9945，表明异鼠李素在0.0027-1.2478 mg/mL与峰面积呈良好线性关系;Y=452.842X+0.0149，R2=0.9916，表明川陈皮素在0.0019-1.2407 mg/mL与峰面积呈良好线性关系;Y=597.675X+0.0473，R2=0.9938，表明毛蕊异黄酮在0.0018-1.1389 mg/mL与峰面积呈良好线性关系;Y=653.714X+0.0673，R2=0.9942，表明刺芒柄花素在0.0021-1.2370 mg/mL与峰面积呈良好线性关系。见表3。

2.2.4.2 重复性试验 取同一批次的补中益气配方颗粒样品，按“2.2.3”项下方法平行处理，制备供试品溶液6份，按上述“2.2.1”项下色谱条件吸取供试品溶液各10 μL，注入HPLC进行分析。柚皮素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、刺芒柄花素、川陈皮素、毛蕊异黄酮质量分数的RSD分别为1.37%、1.14%、1.71%、1.54%、1.19%、1.27%和0.96%，各个黄酮类化合物的RSD值均小于2%，表明本方法重复性良好。

2.2.4.3 加样回收率试验 取同一批次的补中益气配方颗粒样品，按“2.2.3”项下方法平行处理，制备供试品溶液6份，置于具塞三角烧瓶内，分别加入柚皮素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、刺芒柄花素、川陈皮素、毛蕊异黄酮对照品适量，按上述“2.2.1”项方法处理，测定各个黄酮类化合物的含量。测得柚皮素的平均回收率为99.388%，RSD=1.25%;测得槲皮素的平均回收率为99.209%，RSD=1.49%;测得山柰酚的平均回收率为100.84%，RSD=1.42%;测得异鼠李素的平均回收率为99.138%，RSD=1.38%;测得川陈皮素的平均回收率为100.526%，RSD=0.61%;测得毛蕊异黄酮的平均回收率为101.557%，RSD=1.80%;测得刺芒柄花素的平均回收率为100.500%，RSD=0.73%。见表4。

2.2.5 样品含量测定 将“2.2.3”项目下的供试品溶液按照“2.2.1”的條件进行测定。根据样品中各个黄酮类化合物的出峰面积带入标准曲线中，计算得到样品中柚皮素的含量为5.613 mg/mL;测得槲皮素的含量为1.147 mg/mL;测得山柰酚的含量为0.482 mg/mL;测得异鼠李素的含量为0.239 mg/mL;测得川陈皮素的含量为0.550 mg/mL;测得毛蕊异黄酮的含量为0.947 mg/mL;测得刺芒柄花素的含量为1.371 mg/mL。如图1。

3 讨论

通过TCMSP数据库筛选中益气汤治疗子宫脱垂的关键化合物。得到37个交集靶点，利用Cytoscape软件构建“中药-化合物-交集靶点”网络，其中度值排名靠前的化合物，分别有槲皮素、山柰酚、柚皮素、异鼠李素、刺芒柄花素、川陈皮素、毛蕊异黄酮，推测可能为补中益气汤治疗子宫脱垂的关键化合物。研究发现[11]，槲皮素、山柰酚、异鼠李素等均具有抗炎作用，补中益气汤可能通过降低氧化应激通路、减轻炎症反应等达到治疗子宫脱垂。

采用高效液相色谱法进一步对补中益气汤治疗子宫脱垂的7种黄酮类成分进行含量分析，为补中益气汤的质量控制提供数据支撑。通过二极管阵列检测器全波长扫描，所测的7种黄酮类成分在254 nm处测得各个黄酮化合物的色谱峰均有良好响应，并且在此波长下，其他类型的化合物对黄酮色谱峰峰面积影响较小，所以本实验选取254 nm作为检测波长。考察不同流动相组合，包括水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-甲醇和磷酸水-乙腈，发现0.05%磷酸水-乙腈做为流动相，7种黄酮类化合物的色谱分离效果最好，峰形对称。选取等度洗脱系统时，各个色谱峰不能完全分离，故本实验采取梯度洗脱系统，并根据各个色谱峰出峰位置进一步调整，优化得到2.2.1项下色谱条件。

中药含有的药效成分复杂多样，明确其中关键药效物质对中药的质量控制起到至关重要的作用。通过TCMSP数据库选筛选补中益气汤中治疗子宫脱垂可能的关键化合物，然后建立高效液相色谱测定筛选出的7种黄酮类成分在补中益气汤中的含量方法，经过线性关系考察、重复性实验检测和标准加入实验验证，该含量测定方法灵敏度高，线性关系良好，可重复性高，表明该方法稳定、可靠、准确，为补中益气汤的质量控制综合评价提供了更加全面的参考。

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（收稿日期：2021-09-26）