过表达miR-769-5p对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响和机制

朱克鹏，肖勋蓉，罗义，弋文，尹均明，杨川，何英，杜果城

川北医学院附属南充市中心医院,四川南充637000

乳腺癌是威胁女性健康的最常见恶性肿瘤之一，也是全世界范围内女性癌症相关性死亡的主要原因[1]。近年来乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，并且呈现年轻化趋势[2]。虽然目前乳腺癌在诊断和治疗方面已经取得显著的进步，病死率降低。然而，即使采用标准治疗，乳腺癌的复发转移仍然是患者最常见的死亡原因。出现复发转移的乳腺癌患者的治疗效果仍不能令人满意[3]。至今乳腺癌的发生及复发转移机制尚不明确。在过去的几十年中，越来越多的研究证明，包括miRNA表达异常在内的表观遗传的异常与乳腺癌的发生及复发转移密切相关，表观遗传研究目前已经成为乳腺癌的研究热点[4]。miRNA广泛表达于各种正常和病变组织中，其在转录水平调控下游信号通路，参与机体各种生命活动的调控[5]。近期越来越多的研究证明了miRNA在恶性肿瘤诊断和治疗中的潜力[6]。miR-769-5p是最近新发现的与肿瘤有关的miRNA成员之一[7-9]，但miR-769-5p在乳腺癌发生发展中的作用仍不清楚。2020年8月—2021年3月，本实验旨在观察miR-769-5p在乳腺癌细胞中的表达情况，探讨miR-769-5p对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIzol试剂购自北京康为世纪公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自武汉博士德公司；逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自大连宝生物公司；miR-769-5p模拟物、模拟物阴性对照、荧光素酶报告基因质粒均购自上海吉玛公司；荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；PCR引物购自广州锐博公司；Annexin-V/FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；Transwell小室购自购自美国Corning公司；一抗兔抗人核仁纺缍体相关蛋白1(NUSAP1)和GAPDH抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG购自美国Bioworld公司。

1.2 细胞培养及细胞分组 人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、HCC1806和正常乳腺上皮细胞HBL-100均购自美国菌种保藏中心，人乳腺癌细胞SK-BR-3购自中国科学院细胞典藏库，均培养于含10%胎牛血清的RPMI1460培养基(含1%青霉素—链霉素溶液)，在37 ℃、5% CO2的环境中培养。将对数生长期的HCC1806细胞分为过表达组和对照组，接种于6孔细胞板，当细胞融汇度达70%～80%时更换细胞培养液后应用Lipofectamine2000进行转染，过表达组细胞每孔加入5 μL转染试剂和100 pmol miR-769-5p模拟物，对照组每孔加入5 μL转染试剂和100 pmol 模拟物阴性对照。细胞转染后继续培养24 h，收集细胞进行后续实验。

1.3 细胞中miR-769-5p表达检测 采用qRT-PCR。使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，应用分光光度仪检测RNA的浓度及纯度。应用miRNA逆转录试剂盒进行逆转录获取cDNA。以cDNA为模板，加入PCR引物，应用qRT-PCR试剂盒配置PCR反应体系进行扩增反应。miR-769-5p上游引物序列：5′-CTCTCTTTTGTGACCTGGTCCA-3′，下游引物序列：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′；U6上游引物序列：5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR反应条件设置如下：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环。以U6作为内参，用2-ΔΔCt法计算miR-769-5p的相对表达量。

1.4 细胞增殖活性检测 采用CCK-8实验。收集转染24 h后各组HCC1806细胞，以4×103/孔的密度接种于96孔板中，在37 ℃、5% CO2环境下继续培养24、48、72 h，按照CCK-8试剂盒说明书操作，在上述时点分别向每孔加入加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h后，应用酶标仪测定各孔波长450 nm处光密度(OD)值。

1.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。取转染24 h后各组HCC1806细胞，加入结合缓冲液配置细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液，每组取100 μL细胞悬液置入流式管内，分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI后轻晃混匀，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.6 细胞侵袭、迁移能力检测 采用Transwell实验。侵袭实验时首先将Transwell小室底膜上室面预先均匀铺基质胶凝固成膜。收集转染24 h后各组HCC1806细胞，无血清DMEM培养基重悬制作细胞密度为1×105/mL的细胞悬液，取200 μL细胞悬液加入小室上室，同时在小室下室加入600 μL含10% 胎牛血清的培养基,置于37 ℃、5% CO2环境中继续培养24 h后取出小室，棉签轻轻拭除上室面未穿膜的细胞，甲醛固定细胞、0.1%结晶紫溶液染色后，显微镜下观察计数细胞数目。迁移实验时不对小室底膜上室面预铺基质胶，其他步骤与侵袭实验相同。

1.7 细胞中NUSAP1蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集转染后24 h各组HCC1806细胞，裂解细胞提取细胞总蛋白。每泳道加入50 μg蛋白样品，并通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转法转移至PVDF膜上。洗膜后，应用5%脱脂牛奶封闭液室温环境下封闭1 h，加入稀释的一抗NUSAP1抗体(稀释比1∶1 000)和GAPDH抗体(稀释比1∶2 000)，室温孵育。次日洗膜后加入二抗IgG(稀释比1∶2 000)，ECL显影，Quality One软件分析条带灰度值。

1.8 细胞荧光素酶活性检测 采用双荧光素酶实验。接种HCC1806细胞于24孔细胞板，应用Lipofectamine2000将含野生型NUSAP1′ UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-NUSAP1-WT或含突变型NUSAP1′ UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-NUSAP1-MUT，与miR-769-5p模拟物共转染至HCC1806细胞，并设置共转染模拟物阴性对照作为阴性对照。转染24 h后应用细胞裂解液裂解细胞，按照双荧光素酶检测试剂盒操作说明书检测细胞的荧光素酶活性。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞中miR-769-5p表达情况 miR-769-5p在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCC1806和正常乳腺上皮细胞HBL-100中的相对表达量分别为0.49±0.10、0.57±0.15、0.29±0.11、0.18±0.07、0.98±0.04。miR-769-5p在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCC1806中的表达低于正常乳腺上皮细胞HBL-100(P均<0.05)。

2.2 两组miR-769-5p表达比较 过表达组、对照组miR-769-5p相对表达量分别为5.19±0.36、0.99±0.06，两组相比P<0.01。

2.3 两组细胞增殖活性比较 过表达组24、48、72 h细胞增殖活性均低于对照组(P均<0.05)，见表1。

表1 两组各时点细胞增殖活性比较

2.4 两组细胞凋亡率比较 过表达组、对照组细胞凋亡率分别为(29.44±5.49)%、(6.78±1.76)%，两组相比P<0.01。

2.5 两组细胞迁移和侵袭能力比较 过表达组、对照组迁移细胞数分别为(55±15)、(142±26)个，侵袭细胞数分别为(18±9)、(75±16)个，两组相比P均<0.05。

2.6 两组NUSAP1蛋白表达比较 过表达组、对照组NUSAP1蛋白表达分别为0.23±0.14、0.91±0.18，两组相比P<0.01。

2.7 miR-769-5p对NUSAP1的靶向调控关系验证结果 共转染pMIR-NUSAP1-WT+miR-769-5p模拟物、pMIR-NUSAP1-WT+模拟物阴性对照、pMIR-NUSAP1-MUT+miR-769-5p模拟物、pMIR-NUSAP1-MUT+模拟物阴性对照的HCC1806细胞的相对荧光素酶活性分别为0.52±0.11、1.01±0.02、0.99±0.03、1.03±0.04。共转染pMIR-NUSAP1-WT+miR-769-5p模拟物的HCC1806细胞的相对荧光素酶活性明显低于共转染pMIR-NUSAP1-WT+模拟物阴性对照的HCC1806细胞(P<0.05),而共转染pMIR-NUSAP1-MUT+miR-769-5p模拟物与共转染pMIR-NUSAP1-MUT+模拟物阴性对照的HCC1806细胞的相对荧光素酶活性比较差异无统计学意义。

3 讨论

在世界范围内，乳腺癌的发病率排在全部恶性肿瘤的第一位，乳腺癌目前仍是威胁妇女健康的第一杀手[10]。进一步研究乳腺癌进展的分子机制，寻找针对乳腺癌靶向治疗的关键靶基因非常必要。miRNA是一类含有约22个核苷酸的小分子非编码RNA[11]。近年来，越来越多的证据表明，miRNA与包括乳腺癌在内的多种癌症的进展及预后有关[12]。例如，miR-106b-5p通过靶向CNN1和调节Rho/ROCK1途径促进乳腺癌的肺转移[13]。miR-137通过靶向DUSP4抑制上皮—间质转化，减轻乳腺癌对阿霉素的耐药性[14]。因此，miRNA可能是一种有前途的乳腺癌肿瘤标志物和靶向治疗的靶点基因。

miR-769-5p是近年来发现的miRNA家族重要成员之一，其定位于人染色体19q13.32，目前研究已经证实miR-769-5p在多种肿瘤组织和细胞中表达异常，在口腔鳞癌[8]、膀胱癌[15]、非小细胞肺癌[16]、视网膜母细胞瘤[17]等恶性肿瘤中表达升高，作为癌基因起着促进肿瘤发生发展的作用，但在胃癌[7]、肝细胞癌[18]、恶性胶质瘤[9]中表达降低，作为抑癌基因抑制肿瘤的发生发展，提示miR-769-5p在不同的恶性肿瘤中存在明显的异质性，可能通过不同的信号通路发挥不同的作用。至今，miR-769-5p在乳腺癌发生发展中的作用仍不清楚。本研究通过对MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCC1806等多个乳腺癌细胞系的检测显示，miR-769-5p在乳腺癌细胞中的表达低于正常乳腺上皮细胞，提示乳腺癌细胞中异常低表达的miR-769-5p可能作为抑癌基因发挥作用。由于miR-769-5p在HCC1806中的表达最低，因此选择HCC1806细胞作为后续研究细胞。本研究结果显示，上调miR-769-5p后，HCC1806细胞的增殖活性下降，细胞凋亡率升高，提示上调miR-769-5p能够抑制HCC1806细胞的生长。进一步研究发现，上调miR-769-5p后迁移和侵袭穿膜细胞数目均减少，提示上调miR-769-5p能够抑制HCC1806细胞的迁移和侵袭能力。以上实验结果显示，上调miR-769-5p后，乳腺癌细胞的生长、侵袭及转移能力均明显下降，但至今其调控肿瘤细胞生物学行为的下游分子通路尚不清楚。

NUSAP1属于微管相关蛋白，其基因定位于人染色体15q15.1，在细胞有丝分裂纺锤体的装配、染色体分离以及细胞分裂调控中起着重要的作用。NUSAP1在多种恶性肿瘤中均存在高表达，并且与癌细胞肿瘤学行为及患者的不良预后明显相关。SUN等[21]发现，NUSAP1在乳腺癌组织中高表达，并且NUSAP1表达越高，患者生存时间越短，抑制NUSAP1能够下调乳腺癌细胞的增殖活性和侵袭能力。ZHANG等[22]也在研究中发现，NUSAP1在乳腺癌组织样本和细胞中高表达，沉默NUSAP1能抑制细胞的生长、迁移和侵袭，并增加癌细胞对表阿霉素诱导的凋亡的敏感性。近期研究证实miR-769-5p能够通过靶向NUSAP1调控膀胱癌细胞的生长[15]。本研究发现，上调miR-769-5p后，HCC1806细胞中NUSAP1蛋白表达下降，且双荧光素酶实验证实miR-769-5p存在对NUSAP1的靶向调控关系，提示上调miR-769-5p对HCC1806细胞生物学行为的影响，可能是通过靶向调控NUSAP1基因实现的。

综上所述，miR-769-5p在乳腺癌细胞中呈低表达，在乳腺癌的生长转移过程中起抑制作用，过表达miR-769-5p可能通过靶向NUSAP1基因抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡。