高血压性脑出血患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平变化及临床意义

臧雪风，史明语，王礼玲

盐城市第一人民医院神经内科，江苏盐城224000

高血压性脑出血(HICH)是自发性脑出血的常见类型之一，占所有自发性脑出血的50%～70%，具有发病率高、致残率高、病死率高的特点[1]。有研究发现，微小核糖核酸(miRNA)参与神经元功能调节，与脑出血后神经行为障碍和神经炎症有关[2]。miR-141-3p是具有神经保护作用的miRNA，可通过抑制促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放减轻缺血性脑卒中介导的神经损伤[3]。在脑出血大鼠模型中，注射miR-141-3p激动剂可缩小血肿体积，减轻血肿周围脑组织损伤[4]。miR-29a-3p是与神经系统疾病相关的miRNA，在儿童自闭症患者表达下调，且与认知功能受损有关[5]，上调miR-29a-3p表达可改善帕金森患者认知功能[6]。目前少见miR-141-3p、miR-29a-3p与HICH关系研究，鉴于此本研究观察了HICH患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平变化，分析其与病情以及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年3月—2020年6月我院收治的167例HICH患者(HICH组)，其中男110例、女57例，年龄55～74(65.23±6.19)岁，根据斯堪纳维亚卒中量表(SSS)评分[7]将患者分为轻型组(0～15分，42例)、中型组(16～30分，67例)和重型组(31～45分，58例)。纳入标准：①HICH符合《自发性脑出血诊断治疗中国多学科专家共识》中的诊断标准[8]；②发病至入院时间小于24 h；③住院时间超过72 h；④年龄18周岁以上。排除标准：①脑外伤史，实验室检查提示凝血功能障碍导致的脑出血；②经颅脑CT/MRI影像检查提示脑血管结构异常、颅内肿瘤、烟雾病等引发的脑出血；③入院后已经形成脑疝或死亡患者。另选择同期于门诊体检的64例健康志愿者为对照组，均排除高血压、心脑血管疾病，其中男44例、女20例，年龄51～78(65.02±6.07)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义。本研究获得我院伦理会批准，受试者或其家属签署同意书。

1.2 血清miR-141-3p、miR-29a-3p检测 HICH组入院后立即(对照组入组当日晨时)采集空腹静脉血3 mL注入干燥试管，待血液凝固后取上清液，3 000 r/min离心10 min(离心半径15 cm)。TRIzolTMplus RNA Purification Kit(美国Invitrogen公司)提取总RNA，Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent公司)评估RNA质量，M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)RNA逆转录为cDNA。StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统(美国赛默飞Applied Biosystems)上进行3次重复PCR分析。反应体系：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μL，RNase-Free ddH2O 21 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，98 ℃变性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循环30次。引物序列：miR-141-3p上游为5′-GGTCCTAACACTGTCTGGTAAAGTGG-3′，下游为5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-29a-3p上游为5′-TTCCTCGGTAGCACCATCTG-3′，下游为5′-TATCCTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′；β-actin(内参)上游为5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游为5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。采用2-ΔΔCt法计算血清miR-141-3p、miR-29a-3p相对表达量。采用BS-280全自动生化分析仪(深圳迈瑞医疗电子股份有限公司)检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)，已糖激酶法检测空腹血糖(FPG)。采用ML-dr3518酶标分析仪(上海酶联生物有限公司)采用酶联免疫吸附试验检测血清TNF-α、IL-1β和IL-6。

1.3 预后影响因素分析 出院3个月后进行格拉斯哥预后(GOS)评分，死亡为1分，植物生存状态为2分，遗留重度残疾为3分，遗留轻度残疾为4分，可正常生活为5分[9]。根据GOS评分将患者分为预后良好组(>4分，87例)，预后不良组(≤4分，80例)。收集HICH患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压家族遗传史、基础疾病、并发症、脑出血部位(基底核区、丘脑、脑室、小脑及脑干)、血肿量[根据田式公式：π/6×长(cm)×宽(cm)×高(cm)计算]、GCS评分、SSS评分[7]、治疗方式(血肿清除手术、去骨瓣减压术、保守治疗)、收缩压、舒张压、血清炎性因子水平以及miR-141-3p、miR-29a-3p水平等临床资料，比较预后良好组与预后不良组临床资料差异，分析影响HICH预后的相关因素。

2 结果

2.1 两组血清miR-141-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比较 HICH组血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于对照组(P均<0.01)，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于对照组(P均<0.01)，见表1。

表1 HICH组、对照组血清miR-141-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比较

2.2 不同病情严重程度患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比较 重型组血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于中型组和轻型组，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于中型组和轻型组(P均<0.01)；中型组血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于轻型组，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于轻型组(P均<0.01)。见表2。

2.3 HICH组血清miR-141-3p、miR-29a-3p与炎症因子的相关性 HICH组血清miR-141-3p水平与TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈负相关(r分别为-0.603、-0.510、-0.571，P均<0.01)，血清miR-29a-3p水平与TNF-α、IL-1β、IL-6水平亦呈负相关(r分别为-0.531、-0.432、-0.605，P均<0.01)。

表2 不同病情严重程度患者血清miR-11-3p、miR-29a-3p和炎性因子水平比较

2.4 HICH预后的影响因素分析结果 预后不良组年龄、血肿量、SSS评分、收缩压、血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于预后良好组，GCS评分、血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平低于预后良好组，两组出血部位分布差异有统计学意义(P均<0.05)，见表3。将上述具有统计学差异项目纳入回归方程，因变量设为HICH预后(预后良好=0，预后不良=1)，ENTER法筛选变量，入α=0.05，出α=0.10，最终高收缩压、小脑及脑干出血是HICH预后不良的危险因素，高水平miR-141-3p、miR-29a-3p是HICH预后的保护因素(P均<0.01)，见表4。

2.5 miR-141-3p、miR-29a-3p对HICH预后不良的预测价值 miR-141-3p、miR-29a-3p预测HICH预后不良的截断值分别为1.03、1.25，曲线下面积分别为0.675、0688，两者联合预测HICH预后不良的曲线下面积为0.898，高于单独指标预测(Z分别为4.950、5.325，P均<0.01)，见表5。

表3 影响HICH预后的单因素分析结果

表4 影响HICH预后的Logistic回归分析结果

表5 miR-141-3p、miR-29a-3p预测HICH预后不良的效能

图1 miR-141-3p、miR-29a-3p预测HICH预后不良的ROC曲线

3 讨论

脑出血是最致命的卒中类型，占所有卒中类型的10%～30%，高血压是自发性脑出血的主要危险因素，HICH发病30 d内病死率为40%～50%[10]。目前HICH以降颅压、开颅血肿清除、去骨瓣减压等治疗为主，尚缺乏有效的治疗方法，探讨与HICH有关的生物学指标可为临床治疗提供新的方向和靶点，对预后评估亦有较高应用价值。HICH后可继发血肿周围组织水肿、神经元凋亡和坏死以及神经炎症反应等，其中神经炎症反应以中性粒细胞和巨噬细胞浸润，脑内小胶质细胞和星形胶质细胞激活为特征，持续炎症反应可引起和加重脑出血后继发性损伤[11]。miRNA是长度为22～26个核苷酸的内源性非编码小RNA，可以调节细胞增殖、代谢、凋亡、器官发育等病理生理过程，还可调节巨噬细胞极化以及极化后炎症反应，与脑出血后的神经炎症反应密切相关[2,12]。

miR-141-3p是具有抑制炎症反应作用的miRNA。研究表明miR-141-3p在自身免疫性心肌炎小鼠模型中表达下调，上调miR-141-3p表达可通过抑制信号转导子及转录激活子4表达降低血清炎症因子水平[13]；miR-141-3p还可通过下调下游靶基因高迁移率族蛋白B1抑制IL-1β、TNF-α和IL-6水平，缓解慢性炎症性疼痛[14]；在坏死性小肠结肠炎miR-141-3p通过抑制受体相互作用蛋白激酶1介导的炎症反应和肠上皮细胞坏死性凋亡[15]。miR-141-3p与脑卒中后社会孤立也有关，抑制miR-141-3p表达可减轻脑卒中神经功能缺损，缩小梗死体积，降低病死率[16]。但是miR-141-3p在脑出血的报道十分少见。本研究结果显示miR-141-3p在HICH患者血清中表达下调，且随着神经损伤加重而降低，是HICH患者预后不良的影响因素，说明miR-141-3p在HICH中作用机制与帕金森病和缺血性脑卒中不同，miR-141-3p似乎在HICH发病过程中发挥保护作用。李晓波等[4]报道也指出，miR-141-3p在脑出血患者血清中水平下调，miR-141-3p水平与脑出血血肿严重程度呈负相关，本研究与其结论一致。miR-141-3p在HICH的作用机制尚不清楚，miR-141-3p可能通过靶向NLRP3基因表达抑制炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18水平，降低炎症反应及其介导的神经组织损伤[4]。本研究相关性分析结果显示miR-141-3p水平与IL-1β、TNF-α和IL-6呈负相关，说明miR-141-3p水平缺失可能加重炎症反应，导致HICH病情进展。

miR-29a-3p作为一种肿瘤抑制因子备受肿瘤学界的关注，已知可通过调控靶基因表达抑制癌细胞增殖、侵袭和转移，在恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用[17-18]。miR-29a-3p在神经系统疾病中也出现异常表达，且发挥不同作用机制，现有报道显示miR-29a-3p在正常脑组织中高表达，通过靶向ROBO1的3′-UTR抑制轴突导向受体蛋白1表达，继而抑制缺氧诱导的上皮间质转化和血管生成拟态形成，抑制胶质瘤细胞迁移[19]。miR-29a在阿尔茨海默病患者脑脊液中表达增加，被认为是阿尔茨海默病的候选生物标志物[20]，而血管性痴呆患者血浆miR-29a-3p水平下调，miR-29a-3p水平与认知水平呈负相关[21]，体外研究则显示miR-29a-3p通过靶向开放阅读框72基因抑制阿尔茨海默病模型细胞凋亡，促使其存活[22]。本研究发现miR-29a-3p在HICH患者血清中水平下调，低水平miR-29a-3p与HICH病情加重以及预后不良均有关，表明miR-29a-3p可能在HICH中发挥保护作用。分析可能的机制为miR-29a-3p表达缺乏可能导致其靶基因Ⅰ型胶原蛋白α2链表达上调，进而促使颅内动脉Ⅰ型胶原蛋白沉积，降低血管壁弹性，导致血管破裂出血[23]。本研究相关性分析发现,miR-29a-3p与IL-1β、TNF-α和IL-6呈负相关，表明miR-29a-3p参与HICH炎症反应过程，推测miR-29a-3p表达缺失可能诱导炎症因子大量释放，放大炎症反应，加速血脑屏障破坏和脑水肿严重程度，继而加重神经系统损伤。miR-29a-3p对炎症因子调节可能通过靶向调控其下游基因Kruppel样因子4(KLF4)实现，miR-29a-3p表达缺失，KLF4表达上调，KLF4过表达进一步诱导炎性因子TNF-α、IL-10、单核细胞集落刺激因子等炎性介质产生，加速动脉管壁硬化进程[23]，导致动脉破裂出血和神经损伤。

通过ROC分析发现，miR-141-3p、miR-29a-3p均具有一定预测HICH预后的效能，但是单独使用预测效能不理想，联合两项指标后预测效能有所提高，提示联合miR-141-3p、miR-29a-3p可为HICH患者预后评估提供辅助参考信息。回归分析结果显示高收缩压、小脑及脑干出血与HICH患者预后也存在密切关系，分析为收缩压越高血管破损程度越重，出血量越多，神经损伤越重；小脑及脑干出血尤其是脑干部位出血直接影响人体心跳和呼吸等重要生理功能，严重者可导致死亡[1]。

综上可见，HICH患者血清miR-141-3p、miR-29a-3p水平均降低，低水平miR-141-3p、miR-29a-3p与HICH患者神经损伤程度加重以及预后不良均有关，低水平miR-141-3p、miR-29a-3p可能通过促使炎症反应参与HICH发病和进展过程。本研究局限之处在于尚未能直接证实miR-141-3p、miR-29a-3p在HICH发病机制中的作用，这仍待进一步开展基础研究证实。