双氢青蒿素通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制AngⅡ诱导大鼠心肌纤维化

范红娟,栗志英,李俊娇,张素华，蔡安盛,姚晓华，杜相珠

(1.邯郸市中心医院 老年病一科,河北 邯郸056002；2.河北工程大学附属医院 a心血管内一科；b急诊科；c呼吸内科；3.邯郸市精神病医院；4.邯郸市第一医院 血液科)

慢性心力衰竭是各种心血管疾病的最终阶段，其主要病理表现即心肌组织的纤维化改变。正常生理状态下，心肌成纤维细胞处于静止状态，当心肌发生损伤时心肌成纤维细胞即发挥其修复效应，细胞开始增殖、分化、细胞外基质分泌，激活的成纤维细胞迁移至受损心肌组织区域，最终导致心肌纤维化的发生[1-2]。心肌纤维化主要表现为心肌间质中胶原纤维过度蓄积、不同类型的胶原比例失调、序列混乱等一系列结构性改变，会导致心肌收缩、舒张功能失调。心肌成纤维细胞是心室重构、心肌纤维化的关键性调节因子，因此限制其增殖、分化对减缓心室重构、病理性心肌纤维化具有重要意义[3]。青蒿是抗疟药物，随着研究的开展，目前对于青蒿素的研究已经不仅仅局限于治疗疟疾，而是拓展至抗炎、抗肿瘤、抗血管生成、抗真菌、抗纤维化等领域[4]。青蒿素的衍生物包括青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素，其中双氢青蒿素是青蒿素在体内的主要活性成分，是水溶性半合成产物，具有易吸收、低毒性等特点。近年来，双氢青蒿素的抗纤维化作用成为研究热点，且集中在肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化等领域，本研究拟对其在心肌纤维化方面的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取1-3天的SD乳鼠8只，其中雌性6只、雄性2只，共同饲养于恒定湿度、温度的清洁级实验动物房内。双氢青蒿素(上海纯优生生物科技有限公司)、血管紧张素Ⅱ、二甲基亚砜(美国Sigma公司)、Ⅰ型胶原抗体、Ⅲ型胶原抗体(英国Abcam公司)、Smad-3抗体、P-Smad-3抗体(美国CST公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)、转化生长因子β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)购自美国Santa Cruz生物科技公司。TGF-β1试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养

无菌条件下对乳鼠开胸，快速取出心脏，并立即置于D-Hanks液漂洗3次，使用眼科剪剪成1 mm3的碎块。D-Hanks液弃去后加浓度为0.1%的胰蛋白酶消化液、混匀，置于37℃培养箱中消化30 min，加入10%胎牛血清的培养基终止消化，使用吸管轻吹均匀后吸出至离心管中，1 000 r/min离心2 min，弃去下层组织碎片，再1 000 r/min离心10 min、弃上清，加10%胎牛血清的培养基，使用吸管反复轻吹成单细胞悬液，接种至6孔板内，置于5%的CO2培养箱37℃环境下孵育60 min，吸弃贴壁不牢或未贴壁细胞，加入新鲜培养基，置于5%的CO2培养箱37℃环境下继续培养，48 h换第一次液，随后每72 h换液1次，成纤维细胞贴壁速度较快，会先附于瓶底，待成纤维细胞融合度达80%-90%时以0.1%胰蛋白酶消化传代，将第2-4代生长状态良好的细胞留于实验所用。

1.3 细胞分组

将成纤维细胞分为3组：对照组、双氢青蒿素组、TGF-β1组，各20份。对照组的细胞加入含10%胎牛血清的培养基，双氢青蒿素组细胞加入双氢青蒿素5 μmol/L，TGF-β1组细胞加入20 ng/ml的TGF-β1溶液。

1.4 细胞增殖率测算

采用MTT比色法对各组细胞增殖情况进行计算。各组给予对应的药物干预24 h、48 h、72 h，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，培养4 h，弃去上清液，每孔加二甲基亚砜150 μl，振荡10 min，应用酶标仪测定各孔波长在490 nm处的光密度值(OD值)，计算其细胞增殖率。细胞增殖率=OD值/对照组OD值；各组增殖率均计算3次，取均值。

1.5 细胞中mRNA表达及蛋白表达

1.5.1mRNA表达的检测 总RNA：取对数生长期心肌成纤维细胞5×104个/ml，接种于6孔板中，在37℃、5%的CO2的饱和湿度下培养24 h，换无血清培养基，并使用1%胎牛血清的IMDM培养24-48 h，按分组情况给药，并给予AngⅡ处理24 h，弃去培养液，使用焦碳酸二乙酯生理盐水洗涤细胞2次，加入裂解液，待细胞完全裂解后加入氯仿0.2 ml，混匀、离心、取上层水相，加异丙醇0.5 ml，混匀、离心，沉淀RNA，再加75%乙醇除盐，离心、沉淀。逆转录反应：在总RNA管中加缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、去离子水，并置于恒温水浴(42℃)中1 h。PCR反应：在0.2 ml薄壁PCR管中加PCR合成缓冲液、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶、去离子水，混匀，并在热循环仪上进行反应；按照95℃孵育5 min-94℃孵育1 min-50℃孵育1 min-72℃孵育1.5 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。取PCR扩增产物、溴乙叮染色，紫外投射反射仪观察扩增产物，使用凝胶分析系统对扩增条带进行分析，以平均灰度值作为基因表达量，再除以β-actin的灰度值，即为各扩增产物mRNA的相对表达量。

1.5.2检测蛋白表达 加入抗体后4℃孵育过夜，PBS洗涤2次，离心、弃上清液，除去非特性结合的一抗，加入染色液稀释的二抗，37℃避光孵育45-60 min，使用300目尼龙网过滤，上机检测，根据FITC被激发出的荧光确定蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

应用SPSS16.0软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，计数资料以“例(%)”表示，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，以α=0.05为检测水准。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖活力

从表1可以看出，不同时间点下与对照组相比TGF-β1能够明显提高代谢率，TGF-β1组与对照组比较，差异有统计学意义(t=4.96、1.66、12.65，P<0.05)。与TGF-β1组比较，双氢青蒿素组各时间点的增殖活力均低，组间差异有统计学意义(t=6.32、11.07、6.00，P<0.05)。

表1 MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖活力

2.2 各组TGF-β1的mRNA与蛋白表达

与对照组比较，双氢青蒿素组与TGF-β1组的TGF-β1 mRNA表达及蛋白水平均升高，组间差异有统计学意义(t=1.79、25.46、40.93、38.46，P<0.05)。双氢青蒿素组与TGF-β1组比较，TGF-β1 mRNA表达及蛋白水平均低，组间差异有统计学意义(t=23.61、10.00，P<0.05)，见表2。双氢青蒿素组TGF-β1 mRNA与蛋白表达呈正相关性(r=0.374，P=0.041)，见图1。

表2 各组TGF-β1 mRNA及蛋白表达

图1 双氢青蒿素组TGF-β1 mRNA与蛋白表达相关性

2.3 各组Smad2、Smad3蛋白表达

与对照组比较，双氢青蒿素组与TGF-β1组的Smad2、Smad3蛋白表达均高，组间差异有统计学意义(t=2.17、4.78、1.23、3.14，P<0.05)。双氢青蒿素组与TGF-β1组比较，Smad2、Smad3蛋白表达均低，组间差异有统计学意义(t=3.69、2.91，P<0.05)，见表3。

表3 各组Smad2、Smad3蛋白表达

3 讨论

心肌纤维化是多种心血管疾病病理改变的结果，心肌病、高血压、心力衰竭、冠心病与心肌纤维化关系紧密，心肌纤维化能引起心脏功能、结构改变，是中重度冠状动脉粥样硬化性狭窄引起的心肌纤维持续性和(或)反复加重的心肌缺血缺氧所致，最终可发展为心力衰竭的慢性缺血性心脏病[5-7]。对心肌纤维化发展的抑制是防治各种心血管疾病的重要措施。TGF-β由一类功能、结构相关的多肽生长因子组成，具有多个亚型，在调节纤维结缔组织增生、胶原沉积与合成方面都具有重要作用，具有抑制细胞生长、调节细胞外基质的生成和降解作用，是多因素心肌纤维化的共同通路[8-9]。本次研究结果显示，双氢青蒿素能够降低心肌成纤维细胞活性，且随着作用时间的延长而抑制作用增强。TGF-β1是一种多功能细胞因子，具有调节细胞分化、增殖以及细胞外基质产生等作用，与纤维化疾病密切相关[10]。从本次研究结果来看，TGF-β1 mRNA与蛋白表达呈正相关性，与TGF-β1组比较，双氢青蒿素组对TGF-β1具有明显的降低作用。

Smads是TGF-β1的重要下游信号分子，TGF-β1与其受体结合后能够激活Smads蛋白，调节相关细胞因子表达，在纤维化发展中具有重要作用。Smads蛋白是心肌纤维化最重要的影响因子，其中Smad2、Smad3在TGF-β刺激下发生的磷酸化，能够增强成纤维细胞活力，增加胶原蛋白合成、沉积，在组织重塑和纤维化中发挥着重要作用[11-13]。TGF-β/Smads通路是促进组织纤维化的重要信号通路，在肝脏、心脏等多种组织中被证实具有调节成纤维细胞活力、胶原代谢的作用[14-15]。有研究发现，心肌梗死后大鼠的TGF-β/Smads信号通路被抑制，心肌纤维化、心功能等均有改善[16]。还有学者指出，调节TGF-β信号通路能够减弱心肌梗死后心肌纤维化的进程[17]。阿伐他丁、辛伐他丁等药物通过下调转化生长因子激活激酶1，减少TGF-β/Smads通路蛋白表达，从而抑制间质纤维化及心肌纤维化。多项研究表明，miR-113a、miR-24、miR-1908等均是通过调整TGF-β/Smads信号通路来改善心肌梗死后的心肌纤维化状态[18-19]。从本实验结果来看，双氢青蒿素组的Smad2、Smad3蛋白表达水平均低。

青蒿是复合花序植物黄花蒿茎叶中的提取物，其中的双氢青蒿素是青蒿素的重要衍生物，具有多种良好的生物学功效。多项研究发现，双氢青蒿素能够减少纤维组织增生；应用双氢青蒿素原药对肝纤维化小鼠进行灌胃后，发现小鼠肝细胞发生变形，成纤维细胞增殖降低；在一项肺纤维化实验中，双氢青蒿素在抑制肌成纤维细胞增长、胶原纤维合成方面具有积极作用；以上实验均说明双氢青蒿素通过抑制成纤维细胞的增殖来干预脏器的纤维化发展[20]。综合本次研究的观察项来看，双氢青蒿素对心肌成纤维细胞的TGF-β/Smads信号通路具有明显的抑制作用。

综上所述，双氢青蒿素对心肌成纤维细胞的TGF-β、Smads2、Smad3具有明显的抑制作用，能够明显抑制TGF-β/Smads信号通路的传导。鉴于TGF-β/Smads信号通路与其他信号通路存在交叉，在下一步研究中将进一步探讨双氢青蒿素对心肌成纤维细胞多通路的作用机制，为临床合理应用提供参考。