沉默circ_0000745通过靶向miR-296-5p对结直肠癌细胞增殖及转移的影响*

覃先蓬,赵高平,杨 春,朱学强,刘 浩,杨 洲△

四川省人民医院1胃肠外科 2肿瘤科 成都 610072

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为临床恶性肿瘤类疾病之一,在医疗技术水平不断提高的背景下,与之相关的治疗方式也呈现多元化并对临床诊疗有效性产生积极影响,但对处于中晚期的结直肠癌患者进行观察研究发现该类患者人群预后效果仍未见明显改善,目前竞争内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)成为探究结直肠癌发病机制的基础[1-2]。环状RNA(circular RNA,circRNA)属非编码序列RNA分子,且不具备5′端帽子结构与3′端多聚腺苷酸尾巴结构,其中包含微小RNA(microRNA,miRNA)的反应元件并可竞争结合miRNA,还可能参与结直肠癌发生及发展过程[3-4]。针对宫颈癌组织细胞的观察研究发现circ_0000745显著上调,且宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭活动更为活跃[5]。但circ_0000745与结直肠癌相关研究报道相对较少。Circular RNA Interactome研究资料中针对circ_0000745与miR-296-5p的预测结果表明两者存在结合位点。研究表明miR-296-5p在结直肠癌变细胞所呈现的表达变化一定程度上会对癌变细胞活跃度带来影响,当其表达呈上升趋势时结直肠癌变细胞增殖活动减弱,提示miR-296-5p对结直肠癌细胞增殖活跃度具有一定抑制作用,可进一步缩短细胞凋亡时间[6]。但miR-296-5p上游的ceRNA分子机制尚未阐明。因此,本研究主要探讨circ_0000745是否可通过靶向调控miR-296-5p表达而调节结直肠癌细胞增殖及转移。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取2013年3月～2016年7月本院收治且术中切除组织经病理确诊的结直肠癌患者65例作为研究对象,男35例,女30例,年龄56～67岁,平均年龄(60.21±3.16)岁。病理分级:Ⅰ～Ⅱ级45例,Ⅲ～Ⅳ级20例;所有患者均未合并癌栓;临床分期:Ⅰ～Ⅱ期40例,Ⅲ～Ⅳ期25例。将癌组织及癌旁组织制作石蜡标本。参与本研究的患者或其近亲家属知情并同意参与本研究,本研究内容及各项流程均满足《世界医学协会赫尔辛基宣言》审核标准要求,并经院伦理委员会审批同意。随访5年,65例患者中死亡9例,存活56例。

人结直肠癌细胞HCT-116及HT-29均购自美国ATCC;DMEM培养液、胎牛血清、CCK-8均购自上海碧云天生物技术有限公司;LipofectamineTM3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen公司;Trizol试剂购自美国Thermo Fisher公司;逆转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化公司;si-NC、si-circ_0000745、miR-NC、miR-296-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-296-5p等购自广州瑞博生物;Transwell小室、Matrigel基质胶、酶活性双荧光素酶检测试剂盒等购自北京索莱宝公司;双荧光素酶报告基因载体购自美国Promega公司;兔抗人基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、山羊抗兔IgG与HRP标 记 的二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验筛选 HCT-116及HT-29细胞分别置入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液,放在37℃、5%CO2培养箱中培养,观察细胞生长融合状态,当细胞生长融合面积占培养液面积70%。采用“1.2.3”项下方法检测两种细胞的circ_0000745 mRNA、miR-296-5p mRNA表达。

1.2.2 分组 HCT-116细胞置入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液,放在37℃、5%CO2培养箱中培养,观察细胞生长融合状态,当细胞生长融合面积占培养液面积70%,严格按照LipofectamineTM3000 Transfection Reagent说明书作转染操作,根据是否经转染操作,将HCT-116细胞分为沉默对照 组(si-NC)、沉 默circ_0000745组(si-circ_0000745)、空白转染组(miR-NC)、miR-296-5p过表达组(miR-296-5p mimics)、沉 默circ_0000745及抗-miR-296-5p对照组(si-circ_0000745+anti-miRNC)和 沉 默circ_0000745及 抗-miR-296-5p组(sicirc_0000745+anti-miR-296-5p),各组细胞经转染操作后以DMEM完全培养液并加10%浓度的胎牛血清培养48 h后进行指标检测。

1.2.3 实时定量PCR(qRT-PCR)检测circ_0000745、miR-296-5p的表达水平 结直肠癌组织、癌旁组织与各组HCT-116细胞研磨后加入Trizol试剂提取总RNA,以2μg RNA进行逆转录及cDNA的逆转录合成,反应条件:95℃持续预变性反应2 min,变性反应持续60 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40次循环。GAPDH为内参,基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法。各引物序列如下,GAPDH上 游:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′;circ_0000745上 游:5′-ATGTTGAAAGTAGCCCGAGCAG-3′,下游:5′-TGGGAGTGTTGGAAGAAGTTGG-3′;miR-296-5p上游:5′-ATGGCGGACGAGGAGAAGCTGC-3′,下游:5’-TCACTCAGTGCGGAGGATGATG-3’。比较癌组织、癌旁组织及各组HCT-116细胞circ_0000745、miR-296-5p相对表达,考察circ_0000745、miR-296-5p表达与预后的关系。

1.2.4 CCK-8实验检测细胞增殖活动 将各组细胞置于96孔板中,每孔加入CCK-8溶液10μL,2 h后在450 nm波长处以酶标仪完成对吸光度(A)值的检测,计算细胞存活率:存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.2.5 平板细胞克隆形成实验 将各组细胞置于6孔板中,于37℃、5%CO2培养箱培养14 d,应用预冷PBS洗涤,-20℃下甲醇固定20 min,37℃下以1%结晶紫染色液染色15 min,蒸馏水洗涤并晾干,观察并记录细胞克隆数量。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 迁移实验:收集各组细胞,浓度调节至2×105个/m L,按照200μL/孔方式置于上室,600μL含10%胎牛血清的培养液置于下室,37℃、5%CO2培养24 h,多聚甲醛固定20 min,采用0.1%结晶紫染液染色10 min,镜下观察迁移细胞并计数。侵袭实验:用Matrigel基质胶稀释液包被Transwell小室并置于培养箱内,持续5 h,后续步骤同迁移实验。

1.2.7 双荧光素酶报告实验检测circ_0000745与miR-296-5p的靶向关系 将circ_0000745与miR-296-5p的结合位点克隆至p GL3质粒中构建野生型载体WT-circ_0000745,点突变试剂盒将结合位点进行突变后克隆至p GL3质粒中构建突变型载体MUT-circ_0000745,采用脂质体转染法将荧光素酶报告基因载体分别与miR-NC或miR-296-5p mimics行转染操作,置于培养箱内培养48 h,采用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.8 Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达量 PBS对各组细胞洗涤,加入500μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白,采用BCA法检测细胞蛋白浓度,将细胞蛋白在100℃高温下变性10 min,取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜,用5%脱脂牛奶封闭2 h,加入MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)一抗与内参GAPDH抗体(1∶3000)稀释液,4℃孵育过夜,加入二抗稀释液(1∶5000)在37℃下孵育2 h,采用Quantity One软件半定量MMP-2、MMP-9蛋白表达。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 结直肠癌组织中circ_0000745与miR-296-5p的表达及其与结直肠癌预后的关系

与癌旁组织比较,结直肠癌组织中circ_0000745表达明显增高(P＜0.05),miR-296-5p明显降低(P＜0.05),见图1。随访5年,65例患者中死亡9例,存活56例。与存活患者相比,死亡患者的circ_0000745明显增高(P＜0.05),miR-296-5p明显降低(P＜0.05),见图2。

图1 circ_0000745与miR-296-5p在结直肠癌中的表达量比较Fig.1 Comparison of expression levels of circ_0000745 and miR-296-5p in colorectal cancer

图2 circ_0000745与miR-296-5p在结直肠癌存活及死亡患者的表达量比较Fig.2 Comparison of the expression levels of circ_0000745 and miR-296-5p in colorectal cancer tissues of survival and dead patients

2.2 circ_0000745与miR-296-5p在HCT-116及HT-29细胞中的表达

与HT-29细胞比较,HCT-116中circ_0000745与miR-296-5p表达明显更高(均P＜0.05),见图3。

图3 HCT-116及HT-29细胞circ_0000745与miR-296-5p表达Fig.3 circ_0000745 and miR-296-5p expression in HCT-116 and HT-29 cells

2.3 沉默circ_0000745对HCT-116细胞增殖能力的影响

与si-NC组比较,si-circ_0000745组细胞circ_0000745被明显敲低,且细胞存活率降低(均P＜0.05),细胞克隆形成数量减少(P＜0.05),见图4。

图4 沉默circ_0000745对HCT-116细胞增殖能力的影响Fig.4 The effect of silencing circ_0000745 on the proliferation of HCT-116 cells

2.4 沉默circ_0000745对HCT-116细胞迁移及侵袭能力的影响

si-circ_0000745组较si-NC组细胞迁移及侵袭活跃度降低,发生迁移及侵袭的细胞数量明显减少(均P＜0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低(均P＜0.05),见图5。

图5 沉默circ_0000745对HCT-116细胞迁移及侵袭的影响Fig.5 The effect of silencing circ_0000745 on the migration and invasion of HCT-116 cells

2.5 双荧光素酶报告实验验证circ_0000745与miR-296-5p的靶向调控作用

circ_0000745与miR-296-5p具备共有序列段表现。miR-296-5p过表达引起野生型载体WT-circ_0000745的荧光素酶活性下降(P＜0.05)。与si-NC组的miR-296-5p进行比较,si-circ_0000745组呈现更高表现(P＜0.05);与pcDNA组就miR-296-5p展开比较,pcDNA-circ_0000745组呈低表现(P＜0.05)。见图6。

图6 双荧光素酶报告实验验证circ_0000745与miR-296-5p的靶向调控作用Fig.6 The dual luciferase report experiment verified the targeted regulation of circ_0000745 and miR-296-5p

2.6 miR-296-5p过表达对HCT-116细胞增殖、迁移及侵袭活动的影响

过表达miR-296-5p mimics的miR-296-5p组较miR-NC组细胞存活率下降,且MMP-2、MMP-9蛋白表达水平下降(均P＜0.05),细胞克隆形成数下降,且迁移和侵袭细胞数量减少(均P＜0.05),见图7。

图7 miR-296-5p过表达对HCT-116细胞增殖、迁移及侵袭活动的影响Fig.7 Effect of miR-296-5p overexpression on HCT-116 cell proliferation,migration and invasion

2.7 抑制miR-296-5p表达联合沉默circ_0000745对HCT-116细胞增殖、迁移及侵袭的影响

与si-circ_0000745+anti-miR-NC组比较,sicirc_0000745+anti-miR-296-5p组细胞存活率和MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(均P＜0.05),细胞克隆形成数量、迁移及侵袭细胞数量明显增多(均P＜0.05),见图8。

图8 抑制miR-296-5p表达联合沉默circ_0000745对HCT-116细胞增殖、迁移及侵袭的影响Fig.8 The effect of inhibiting the expression of miR-296-5p and silencing circ_0000745 on the proliferation,migration and invasion of HCT-116 cells

3 讨论

circ RNA是由外显子或内含子的套索驱动活动而形成的一类具备闭合环状特征的共价结构,核酸外切酶对其影响甚微,因此circRNA可作为miRNA的海绵分子而充当miRNA的ceRNA。关于结直肠癌的临床研究数据显示,该部位出现癌变的组织细胞中可见circRNA存在异常表达现象,提示circRNA的表达变化会对结直肠组织癌变及其发展带来一定影响,还可能作为结直肠癌治疗的潜在靶点[7-10]。

针对宫颈癌的研究显示,circ_0000745呈现高表达时会促进宫颈癌变细胞的增殖及转移[11]。而针对急性白血病的研究中观察到淋巴细胞及白血病细胞的circ_0000745呈现高水平表达,提示该现象发生会诱导急性淋巴细胞白血病细胞增殖活跃度增强[12]。针对口腔鳞状癌变细胞观察circ_0000745变化发现其呈现高表达水平,并可通过充当miR-488的ceRNA对CCND1的表达作正向调控,该研究结果提示其对口腔鳞状细胞癌细胞增殖及细胞转移能力增强起推动作用[13]。但circ_0000745在结直肠癌中的作用尚未可知。本研究结果显示,结直肠癌组织中circ_0000745的表达量升高,5年随访结果亦显示,死亡患者结直肠癌组织中circ_0000745的表达量更高。沉默circ_0000745可降低结直肠癌细胞存活率,细胞克隆形成活跃度降低、数量随之减少,提示沉默circ_0000745可显著抑制结直肠癌HCT-116细胞增殖。MMP-2、MMP-9是具备金属离子特性的蛋白酶,可提升细胞转移活跃度[14]。本研究结果表明,沉默circ_0000745可抑制结直肠癌HCT-116细胞迁移及侵袭,还可抑制MMP-2、MMP-9的表达,提示circ_0000745在维持结直肠癌细胞活力、迁移及侵袭能力方面具有重要作用。

本研究初步证实circ_0000745可充当miR-296-5p的ceRNA,负向调控miR-296-5p的表达。研究表明采用miR-296-5p可靶向HMGA1抑制结直肠癌变细胞增殖[15],降低肝脏及周边具备癌变表现细胞的迁移活跃度[16]。miR-296-5p可对SND1实现有效靶向调控,进而对骨肉瘤细胞增殖及转移活动进行有效抑制[17]。本研究离体HCT-116细胞研究显示,circ_0000745与miR-296-5p呈负相关关系,circ_0000745可通过负向调节miR-296-5p表达而抑制结直肠癌变组织细胞活跃度,提示circ_0000745可充当miR-296-5p的ceRNA,进一步,通过调节或沉默circ_0000745表达可影响结直肠癌细胞增殖及转移活动。

有研究证实MMP-2和MMP-9可由miR-296靶向调控,而miR-296参与脉络膜黑色素瘤细胞增殖、细胞周期进程、迁移、侵袭病理进程[18]。进一步的研究有必要考察miR-296-5p与MMP-2、MMP-9的联系,为结直肠癌的诊治提供更多信息。

综上所述,结直肠癌组织中circ_0000745呈高表达,miR-296-5p呈低表达,高表达circ_0000745及低表达miR-296-5p可用于评估结直肠癌预后。沉默circ_0000745可上调miR-296-5p表达以抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭,circ_0000745/miR-296-5p分子轴在结直肠癌发生及发展过程中可发挥重要调控作用,为后续临床针对结直肠癌症疾病治疗研究提供新的靶向目标和方向。但circ_0000745具有多个miRNA的结合位点,其是否可通过靶向调控其他miRNA而发挥作用尚需进一步探究。