Shh 信号参与神经退行性疾病神经元分化与再生的研究进展*

刘欣媛,陶一鸣,杜艳军,2△,曾 鹏,田 青,李蔚娴

湖北中医药大学 1针灸骨伤学院 2针灸治未病湖北省协同创新中心,武汉 430061

3华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系,武汉 430030

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)和亨廷顿病(Huntington’s Disease,HD)是较为常见的神经退行性疾病,尽管它们的起源、发展及临床表现各异,但神经元数量过少是它们的共同病理特征,神经元丢失过多与神经元再生障碍是引起此病理特征的重要机制之一[1-3]。神经退行性疾病的病变过程其实是内源性神经元分化再生失败的过程[4],目前神经退行性疾病尚无特效疗法,Shh信号作为有丝分裂原,可以促进新皮层生长,调节神经干细胞(neural stem cells,NSCs)直接或间接分化为神经元[5]。Shh信号刺激内源性神经元再生,是探索神经退行性疾病治疗策略的新方向。但关键在于如何有效激发内源性神经元再生以重建功能性神经网络。本文通过对Shh信号通路的组成及其在AD、PD、HD中参与神经元分化与再生的作用机制进行综述,阐明有效激活Shh信号是促进神经元分化与再生的可能途径,以期为治疗神经退行性疾病或延缓其疾病进程提供新思路。

1 Shh信号通路的组成与特性

Hedgehog信号通路对人和动物生长发育过程中细胞增殖起着至关重要的作用,其基因家族包括音猬因子(sonic hedgehog,Shh)、沙漠刺猬因子(desert hedgehog,Dhh)、印度刺猬因子(Indian hedgehog,Ihh)[6]。Shh信号是促进新皮层生长机制的核心,调节NSCs直接或间接产生神经元,影响少突胶质细胞形成和星形胶质细胞增生。如在少突胶质细胞的生成中需要皮质神经元和神经元间的Shh配体,以维持新皮层少突胶质细胞数量正常[7]。在星形胶质细胞中,Shh增加神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,诱导星形胶质细胞转化为反应性星形胶质细胞并从中释放神经胶质递质[8]。还有研究表明可通过抑制Shh信号来维持NSCs静止和激活之间的平衡,以保持神经元活性与突触可塑性[9]。

Shh信号通路的核心部件由分泌型糖蛋白Shh配体、Smoothened(Smo)跨膜蛋白受体、Ptched(Ptch)跨膜蛋白受体、核转录因子Gli家族(Gli-1,2,3)、蛋白激酶A(PKA)、校正器(suppressor of fused,Sufu)等组成。有研究证实在出生后和成年小鼠的皮质、海马和小脑中存在Shh mRNA和Shh-N大量表达,且伴随出生后年龄增长逐渐增加,这与大脑发育相吻合,在此期间神经元和神经胶质细胞均迅速增加,在将神经胶质细胞移除后,Shh蛋白水平没有变化,表明Shh由神经元产生[10]。Smo是一种经过7次跨膜形成的螺旋结构受体,在Shh信号通路中发挥“桥梁作用”。跨膜蛋白受体Patched1(Ptch1)与Smo特异性结合,抑制Shh信号通路[11]。哺乳动物中与特定神经元再生相关的Gli1以正反馈形式激活基因转录,是检测Shh信号通路激活与否的重要指标[12]。

遗传学研究表明,Shh信号的重要转导中心是初级纤毛,纤毛内的Shh信号对腹侧神经管的形成和神经干细胞的调节至关重要(转导通路如图1)[13]。当缺乏Shh信号时,Ptch与Smo结合,Smo活性被抑制,Gli-F在多种激酶作用下磷酸化,并在接头蛋白(β-Tr CP)介导的蛋白水解作用下产生Gli-R抑制靶基因入核;当存在Shh信号时,未与Ptch结合的Smo被磷酸化修饰后,在细胞表面受体样蛋白Cdo等负向调节因子的作用下,聚集和活化于初级纤毛上,Gli-F水解转化为Gli-A后亦促使靶基因入核[14]。此外,Shh信号通路还受相关因子正性或负性调节,如生长抑制特异性蛋白1(growth arrest specific 1,Gas1)与Shh蛋白具有高度亲和力呈正性调节[15],Sufu抑制Gli的转录呈负性调节[16],而糖原合成酶激酶-3(GSK-3)可双向调节Shh信号通路[17]。影响Shh信号通路传导的因素还包括衰老、性别等。如在不同时期Shh信号受激活的蛋白激酶C受体1(Rack1)的相反调控[18],雌性小鼠的海马和皮质层结构可因Ptch1的杂合突变出现小脑过度生长,而雄性却无改变[19]。

图1 初级纤毛中的Hh信号通路Fig.1 Hedgehog signaling pathway in the primary cilium

早期研究发现,Shh在腹侧端脑和下丘脑中表达,并且对皮层下区诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)正常分化为神经元的过程发挥至关重要的作用[20]。与hiPSC相关的神经模型证实:Shh信号可介导hiPSC成为可再生物质来源,用于分化为特定区域功能神经元亚型,并且可以潜在地优化神经修复方案[21]。关于神经系统发育的研究表明,Shh信号通路在成年期可被重新激活,在大脑和脊髓中出现高表达,能介导神经前体细胞的发育模式,诱导成年大鼠海马齿状回NSCs分化成为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞[22]。用腺病毒作为载体将表达Shh信号的DNA片段转运至海马体中,结果发现海马体细胞数目显著增多,而环巴胺(Shh抑制剂)则抑制了海马体神经前体细胞的增殖[23]。研究表明可将Shh作为一种分子标记物,根据其在细胞中不同梯度的表达水平来区分中间神经元、运动神经元等[24]。此外,Shh通路通过上调TJ蛋白(例如occludin和claudin-5)以促进血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的完整性,对小鼠缺血性中风后血脑屏障起到直接保护作用[25]。还可通过激活大鼠的Shh-Gli信号通路增强血管生成,对减轻脑缺血及再灌注损伤有较好疗效[26]。神经系统疾病较为复杂的发病机制,更加凸显了研究靶向Shh信号通路用于治疗神经退行性疾病的潜在意义。

2 Shh信号对神经退行性疾病的影响

2.1 Shh信号与AD

AD的病理特征中神经元丢失过多可能早于β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)异常沉积和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)出现[27],其中胆碱能神经元大量损伤是AD神经退行性改变的基础之一[28]。以胆碱酯酶、N-甲基-D-天冬氨酸(Nmethyl-D-asparticacid,NMDA)、Aβ等为靶点开发的各类临床药物应用,远期效果不佳且产生较强的外周副作用,根本原因可能在于未有效改善神经元进行性减少[29]。早期有研究发现AD患者脑内存在内源性NSCs,但不能被主动激活使得其增殖、迁移和分化出现停滞,但将NSCs移植入AD模型大鼠脑内后,发现AD大鼠海马CA1区突触素的吸光度值和神经元数目明显增多,突触和正性纤维的数量增多,表明外源性NSCs在AD大鼠脑中具有存活、增殖及重建神经通路的能力,而脑内Shh信号则参与了多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)分化为基底前脑胆碱能神经元的过程[30-31]。Hu等[32]用Shh信号激动剂Purmorphamine诱导培养人类多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为神经上皮细胞,实验第20天时,90%hiPSCs源性的神经前体细胞开始在内侧神经节隆起处表达;第35天时,约40%的细胞显示出其前脑神经元样特征;第45天时可见成熟神经元标记物大量表达,充分说明了Shh信号在NSCs向功能性胆碱能神经元分化过程中发挥了良好效应机制。

正常情况下,Shh信号诱导产生高水平的Ptc1和转录因子Gli1,而研究观察发现Ptc1和Gli1在AD转基因小鼠模型的海马中存在显著缺陷,在低龄小鼠脑中明显升高,此现象在AD患者大脑尸检中得到了验证[33]。研究者为了验证Aβ肽是否影Ptc1-Gli1信号传导,用Aβ1-42处理胶质前体细胞(glial precursor cells,GPCs),发现高剂量Aβ1-42显著降低Ptc1-Gli1水平,诱导NSCs/GPCs进入不对称分裂期,最终导致这些前体细胞在Aβ毒性作用下死亡,神经前体细胞储备不足,最终引起AD大脑神经元再生障碍,提示Ptc1-Gli1信号对维持成体大脑神经环路完整性具有重要调控作用[34]。有研究者向AD转基因动物模型APP/PS1小鼠注射内源性神经保护剂蛋白酶(protease nexin-1,PN-1),发现PN-1可参与调控Shh信号通路,减少海马神经元凋亡以恢复神经系统发育进而影响AD发病进程[35]。Shh蛋白水平在海马NSCs/GPCs中升高的现象,进一步提示激活Shh信号通路对成体NSCs/GPCs分化具有促进作用,有助于AD海马区整合新的功能性神经网络以恢复功能障碍。

2.2 Shh信号与PD

中脑黑质致密带多巴胺(dopamine,DA)能神经元缺失、纹状体内DA含量减少是PD的主要病理特征,逆转DA能神经元变性或促进其生成一直是PD的关键治疗靶点[36]。已有报道发现,哺乳动物体内中脑DA能神经元(mDA)能对运动和学习奖励相关的多种行为发挥调节作用,这基于mDA轴突结构异质性,且m DA与在胚胎期所注射的Shh信号激活剂密切相关[37]。

研究发现在PD大鼠模型中,Shh信号在受损的中脑内表达增加,参与恢复PD中脑DA神经元发育[38]。Kriks等[39]将hiPSCs分化的中脑DA能神经前体细胞,经Shh信号与Wnt信号协同激活后植入PD小鼠模型中,PD小鼠经安非他明诱导后的旋转行为、前肢功能障碍以及中脑DA能神经元存活率均得到改善,随后在PD猴模型中也得到相同的结论。有研究发现Shh还可以促进PD模型中特定DA神经元的体外和体内存活,PD动物模型在神经毒素诱导下出现中枢神经系统损伤,注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)可激活小胶质细胞中的Shh信号,可能参与中枢神经系统的修复过程[40]。当然,也有研究提示Shh信号不是诱导DA能神经前体细胞分化的唯一因素。如Suzuki等[41]使用在DA祖细胞中表达的表面标记物来提高PSCs分化为多巴胺能(DA)神经元的效率,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP2)也可在体外促进NSCs向DA神经元的分化。

2.3 Shh信号与HD

HD是一种常染色体显性遗传病,因IT15基因的1号外显子中含有多态性三核苷酸(CAG)的重复序列,CAG重复转录超过36次时,使其编码的Htt蛋白功能发生变异,变异后的Htt蛋白的N端碎片在脑内神经元间隙中聚集,Htt蛋白与激动蛋白发生相互作用导致其异常扩增,从而阻断了轴突运输,最终影响神经元功能[42]。目前研究已证实HD患者纹状体-前脑皮质下区存在神经元的进行性丢失以及神经退行性病变[43]。

黑质DA能神经元和纹状体中间神经元中产生的Shh可参与出生后神经营养环路的形成[44]。Shh信号的短期效应是导致胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)高效分化为DA能神经元的关键,验证了Shh信号促进诱导PSCs分化为特定的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能纹状体中等棘状神经元(MSNs)。经过进一步体内实验发现,被移植到HD小鼠纹状体中的hPSC源性神经元可以存活并分化为多巴胺和c AMP调节的磷蛋白(dopamine and CAMP-regulated phospoprotei,DDRPP-32)阳性神经元,同时HD小鼠在阿朴吗啡(apomorphine,APO)诱导后的旋转行为功能障碍也得到了改善[45]。体外和体内实验结果均验证了Shh信号可参与hPSC源性MSNs的体内移植,发挥改善HD病理模型中行为学表现异常的作用[46]。可以认为Shh信号促进干细胞体内分化是研究HD病理机制的较为理想的方案,更是逆转HD神经退行性病变的重要切入点之一。

3 展望

目前关于体外神经元定向分化的研究结果表明,干细胞移植对包括AD、PD、HD在内的病理模型都有明显的治疗效果[47-49]。既然通过激活脑内Shh信号能辅助促进内源性神经元产生,那么将外源性NSCs植入大脑的特定微环境中,再由Shh信号诱导干细胞增殖分化为具有特定功能的神经元,即可借此突破神经退行性疾病的治疗难点。但是与Shh信号相关的干细胞移植在再生医学领域仍具有较大挑战性,其中体外研究居多,而体内研究较少。具体原因如下:①NSCs移植至脑内后其存活率只有5～10%,同时NSCs分化为神经元效率较低[50];②新生神经元在已受损脑中存活、迁移、分化和整合为功能性神经网络尚有难度;③新生神经元在活体内的检测受到一定制约。