丛枝菌根（AM）真菌扩繁试验研究

黄 金，肖信锦，王慧娟，邓扬悟,2

（1.国家离子型稀土资源高效开发利用工程技术研究中心/江西离子型稀土工程技术研究有限公司 江西，赣州341000；2.江西理工大学 江西，赣州 341000）

离子型稀土矿开采早期，主要采用池浸和堆浸工艺，遗留下来了大量废弃矿区，废弃矿区的立地条件十分恶劣、生境破碎，动植物基本消失。本课题组利用丛枝菌根真菌（以下简称“AM真菌”）+植被修复技术对离子型稀土废弃矿区进行生态修复，并筛选出了摩西斗管囊霉（简称“G.m 真菌”）、根内根孢囊霉（简称“G.i 真菌”）两种AM真菌，对植被在离子型稀土废弃土壤上生长有较显著地促进作用。如何获得大量AM 真菌的菌剂是AM 真菌应用的关键，因此，需对AM真菌的扩繁条件进行研究。

AM真菌具有自身不能进行DNA复制的特性，因此到目前为止，这些真菌的纯培养尚未取得成功，不能像其他可纯培养的微生物一样通过工业发酵，来进行AM真菌菌剂的大规模工业化应用，现有AM真菌生产方法中宿主植物盆栽培养法是最经济、可靠、易行的培养方法，因此可借助宿主植物对菌种进行扩大繁殖。在AM 真菌扩繁过程中，宿主植物和培养基质的选择非常重要。以砂或土为基质较易扩繁AM 真菌，但存在基质成分复杂，需要灭菌处理和接种剂重量大，不便于运输等缺点，离子型稀土矿山基本都分布在矿山相对偏远地区，若要大规模应用，理想的菌剂应具有侵染率高、质轻、便于运输等特点。为生产侵染率高、低成本、质轻的AM真菌菌剂，本试验以高粱和紫花苜蓿作为宿主植物，分别在以沸石、河砂、珍珠岩、蛭石、草炭土5 种原料组成不同配比的3 种基质中进行培养，探索G.m 真菌和G.i 真菌的最佳扩繁条件，为离子型稀土废弃矿山菌剂应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

①供试菌种：G.m 真菌和G.i 真菌均购自于北京市农林科学院植物营养与资源研究所“丛枝菌根真菌种质资源库”（BGC），每盆接种剂量为70g。

②供试植物：高粱、紫花苜蓿种子，均来源于市售，播种前用10%HO灭菌10min 后，清水清洗干净，再用清水浸泡12h。

③培养基质：试验设置三种基质，分别为P1（沸石：河砂：珍珠岩：蛭石=1：2：4：3）、P2（沸石：河砂：珍珠岩：蛭石：草炭土=1：2：3：3：1）、P3（沸石：河砂：蛭石：草炭土=1：2：3：4）（其中数字为体积份数），为排除基质携带的杂菌对试验的影响，配制好三种基质后，基质在烘箱中160℃高温灭菌4h，待自然冷却备用。

培养基质的的理化性质见表1。由表1 可知，P1 至P3，随着草炭土含量提高，基质的有机质、总N、碱解氮、总磷、有效P 等均有大幅提升，而总K 和有效K 含量有所降低，pH值也从中性降低到酸性。

表1 不同培养基质理化性质

④试验器皿

白色塑料花盆，10cm×φ16cm，体积约1350cm，花盆用10%的次氯酸钙消毒灭菌处理。

1.2 试验方案

基质对侵染率的影响：以紫花苜蓿作为宿主植物，分别在3种基质上对G.m真菌和G.i真菌进行扩繁，6处理、3平行样，共18盆。

宿主植物对侵染率的影响：以P2 为培养基质，以高粱为宿主植物对G.m 真菌和G.i 真菌进行扩繁，2 处理，3平行样，共6 盆。试验结果与（1）中P2 作为培养基质，以紫花苜蓿作为宿主植物扩繁结果进行对比。

试验步骤：花盆装好灭菌基质至3/5 体积处（450g），然后将对应的丛枝菌根菌剂均匀覆于基质上层，再覆盖一层薄的基质（100g），然后播种对应的宿主种子（紫花苜蓿约50 颗、高粱20 颗），播种完后再覆一层基质（100g）。种子长出幼苗10d 后间苗，高粱留10 株/盆、紫花苜蓿留25 株/盆。前三 周 每 周喷1 次Hoagland 营养液，每次50mL，后续根据培养基质干湿情况进行适量浇水，室内温度控制在20-28℃，光照时间为14h/d。扩培4个月后检测植株根系菌根侵染和产孢量，菌根侵染率检测用墨水醋染色法，产孢量检测用湿筛倾析法。

2 结果与分析

2.1 培养基质对菌剂扩繁的影响

培养基质的性质决定了水分养分的吸附性能和通气状况，从而影响植物根系的生长以及菌根真菌的繁殖。沸石为大颗粒基质，可保证基质有较好的透气性，河砂可以让多余的水分走掉，而珍珠岩、蛭石、草炭土等基质质量较轻，有利于运输，且能提供一定的营养物质。

侵染率是反应AM 真菌在宿主植物根系侵染状况最重要的指标，侵染率越高，说明其在宿主根系侵染的能力越大，则菌剂质量越好；孢子是AM真菌最重要的繁殖体，孢子的数量可以反映菌剂质量好坏，孢子数量越多，越容易侵染植物根系。以紫花苜蓿作为宿主植物，G.m、G.i两种AM 真菌在不同培养基质下的侵染率及产孢量见表2。

由表2可知：

表2 培养基质对侵染率和产孢量的影响

三种培养基质下G.m 真菌的侵染率高低次序为P1≈P2＞P3，其中P1基质下侵染率略高于P2，而P3基质下侵染率比P1基质低13.75%，三种培养基质主要的区别为草炭土含量不同，其中P3 基质草炭土含量最高，侵染率最低，可能是因为草炭土能为植物的生长提供营养元素，过高的营养元素供给量反而抑制了丛枝菌根的侵染。从侵染率高低的角度评价，G.m 真菌较好的培养基质是P1或者P2。

三种培养基质下G.i 真菌的侵染率高低次序为P1＞P2≈P3，其中P1 基质下侵染率约是P2、P3 基质下的1.25倍，G.i真菌的适宜培养基质为P1。

G.m、G.i两种AM真菌在三种培养基质下侵染率和产孢量均表现出了G.i高于G.m，说明G.i真菌比G.m更易侵染紫花苜蓿。

三种培养基质下G.m 真菌孢子数依次为P2≈P1＞P3，其中P3 基质下孢子数仅为P1、P2 的40%，主要是P3基质中含有较高的草炭土含量，能提供较为充沛的营养，而过高的营养则容易抑制真菌孢子的产生，从产孢量的角度看，P2或者P1基质适合G.m真菌。

三种培养基质下G.i 孢子数依次为P2＞P1＞P3 对于G.i真菌来说，适当的养分有助于孢子的产生，但过量的养分会抑制孢子产生。

2.2 不同宿主植物对菌剂扩繁的影响

由于AM真菌的培养条件变化很大，因此可供选择宿主植物种类很多，一般选用对AM 真菌依赖性较大，对菌种专一性较小，根系发达，且能够忍受高光照条件的植物种，通常选择C4 植物和豆科植物，现有文献报导中已经成功运用的植物种有高粱、三叶草、苜蓿、烟草、苏丹草等。本试验采用高粱、紫花苜蓿作为宿主植物在P2基质中进行菌剂扩繁试验，G.m、G.i两种AM真菌侵染高粱、紫花苜蓿的侵染率与产孢量分别见图1、图2。

图1 宿主植物对菌根侵染率的影响

图2 宿主植物对产孢量的影响

由图1、图2可知，两种AM真菌在紫花苜蓿中的侵染率和产孢量都明显高于高粱，对于G.m真菌，紫花苜蓿的侵染率是高粱侵染率的1.35倍，产孢量是高量的1.19倍；对于G.i 真菌，紫花苜蓿的侵染率是高粱侵染率的1.18倍，产孢量是高量的1.73 倍。因此，两种AM 真菌最佳的宿主植物为紫花苜蓿。

紫花苜蓿和高粱根系侵染状况及对照组根系情况见图3，紫花苜蓿根系绝大部分根段被侵染产生了大量泡囊和少量丛枝结构，而高粱根系则是部分被侵染，产生较多的丛枝和泡囊结构。a)、b)分别为AM 真菌侵染紫花苜蓿和高粱根系；c)、d)分别为空白紫花苜蓿和高粱根系。

图3 宿主植物根系侵染情况

3 结语

本研究探索了培养基质与宿主植物对AM 真菌扩繁的影响，具有以下结论：

对于同一种培养基质，G.m、G.i 两种AM 真菌最佳宿主植物均为为紫花苜蓿，其侵染率和产孢量都显著高于高粱。

培养基质对不同的AM 真菌的扩繁影响不一致。对于G.m 真菌，在P1 和P2 基质下侵染率和产孢量接近，但都明显高于P3基质，从减少培养基质种类的角度看，可选择P1基质作为培养基质；对于G.i真菌，P1基质侵染率高于P2 和P3，但产孢量为P1 显著高于P2、P3，少量的草炭土能为植株和菌根提供适当的营养，综合看，P2基质更适合G.i真菌的扩繁。