以铂类为基础治疗非小细胞肺癌的疗效及与MTHFR C677T基因多态性的相关性分析

靳桂红 王道军 马 朝

肺癌是我国高死亡率的恶性肿瘤，可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌，其中NSCLC约占所有肺癌的80%[1-2]。由于NSCLC早期发病症状并不具备特异性，确诊时多已处于中晚期，以铂类为基础治疗的方法仍是NSCLC患者的主要选择的，但此类化疗方案在不同NCSLC患者中疗效差异较大[3-4]，有研究发现[5]，疗效差异与基因多态性存在密切关联。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTFHR)是一碳代谢途径的限速酶，在DNA的复制和修复中发挥作用。目前有报道发现[6]，不同的突变类型会导致MTFHR酶活性存在差异性，进而影响临床疗效。而C677T位点突变是MTFHR最常见的突变类型，多项研究发现MTHFR C677T基因多态性与肿瘤的发生发展存在相关性[7-8]。因此本研究主要探讨以铂类为基础治疗的NSCLC的疗效及其与MTHFR C677T基因多态性的相关性，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象及临床资料

选取2013年4月～2018年7月我院经病理确诊且行手术切除的NSCLC患者180例为研究组。纳入标准：①东部肿瘤协作组(eastern cooperative oncology group，ECOG)标准评分0～2分；②病理分期为Ⅱ或Ⅲ期；③化疗前血常规、肝肾功能、心功能未见明显异常；④手术切除术后接受铂类药物为基础的辅助化疗；⑤预计生存周期>3个月。排除标准：①术后未接受铂类药物为基础的辅助化疗；②小细胞肺癌者；③不能完成随访者；④术后接受辅助放疗者；⑤合并其他恶性肿瘤者。所有患者于术前或化疗前采集静脉血样本，置于抗凝管中，-80 ℃保存待测。另选择同期于我院进行体检的健康人100名作为健康对照组，两组年龄、性别等资料比较，差异无显著性(P>0.05)。

1.2 化疗方案

术后4～6个周根据研究组患者手术恢复情况予以第1d顺铂75 mg/m2，联合培美曲塞500 mg/m2(非鳞癌)或长春瑞滨25～30 mg/m2第1 d和第8 d。21 d为1个周期，共进行≥4个周期的治疗。

1.3 DNA提取及基因检测

DNA提取：采集EDTA抗凝血250 μl转移至1.5 ml离心管，10000 rpm/min离心1 min，吸去上清后，加入250 μl Elution Buffer，颠倒数次混匀后再加入20 μg蛋白酶K(20 mg/ml)溶液，加入200 μl Buffer BL，立即涡旋振荡充分混匀。将以上混合物加入一条吸附柱AC中，将样品液放入DNA Mini Column中，以12000 rpm/min离心30 s，弃去废液，加入500 μl Buffer KB，以12000 rpm/min离心30 s，弃去废液；再加入 600 μl Wash Buffer，以12000 rpm/min离心30 s，弃去废液；将吸附柱AC放回收集管中，以12000 rpm/min离心2 min，尽量去除漂洗液；取出吸附柱AC，放入1.5 ml离心管，加入120 μl洗脱缓冲液Elution Buffer，水浴箱(65 ℃)5 min，以12000 rpm/min离心1 min。收集DNA溶液，置于-80 ℃保存。基因检测：采用Axygene全血基因组DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA，采用直接测序法测定MTHFR C677T基因多态性，引物序列上游：5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游：5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'。交由上海生工生物工程有限公司合成后，待反应完成后送往公司进行测序。

1.4 随访及预后判定

研究组所有患者均在以铂类为基础的化疗治疗开始后进行随访，随访方式为电话随访或复诊时，频率为每3个月1次，以患者发生复发、转移或全因死亡作为随访终点，截止日期与2020年11月30日。总生存期(OS)计算：患者发生肿瘤复发、转移或全因死亡或末次随访时间与初次随访时间时间差。无复发生存期(RFS)：定义为从开始接受手术切除治疗的时间到患者出现疾病复发或者任何原因引起的死亡。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 MTHFR C677T基因型分布频率

将纳入研究的180例NSCLC患者进行MTHFR C677T基因分型，CC基因型40例(22.22%)，CT基因型73例(40.56%)，TT基因型67例(37.22%)，基因型频率分布进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验(P>0.05)。研究组MTHFR C677TCC基因型频率高于对照组(P<0.05)，CT、TT基因型在两组间的分布频率无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 MTHFR C677T基因型分布频率(例，%)

2.2 MTHFR C677T基因型等位基因频率

研究组C等位基因频率明显高于对照组，T等位基因频率低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 MTHFR C677T基因型等位基因频率(例，%)

2.3 MTHFR C677T不同基因型NSCLC患者预后比较

截止随访时间，180例研究组患者共有9例失访(CC型3例，CT型2例，TT型4例)。所有患者随访时间12～59个月，平均38个月。所有患者中位生存期为31个月，MTHFR C677T基因型CC、CT、TT基因型中位生存时间分别为20个月、25个月、30个月，差异存在显著性(P<0.05)。

2.4 术后接受铂类药物为基础辅助化疗的NSCLC患者OS的影响因素

在校正影响OS单因素分析结果中的年龄、性别、ECOG评分、组织学类型后，发现MTHFR C677T基因型CC是OS的独立影响因素(HR=1.07，P=0.012)，见表3。

表3 术后接受铂类药物为基础辅助化疗的NSCLC患者总生存期的影响因素

3 讨论

NSCLC患者常采用肺癌根治术联合化学药物进行治疗，对降低NSCLC复发率、延长患者生存时间具有显著效果[9-10]。有研究发现[11-12]，以铂类为基础的化疗方案主要用机制是通过破坏细胞复制所必需且关键的叶酸依赖性代谢过程，从而抑制细胞复制，发挥抗肿瘤作用，但会因个体差异产生不同的治疗效果，因此探讨个体基因组差异与药物敏感性的关系，进而制定个性化的治疗方案，对提高治疗效果、延长生存期具有重要意义。

MTHFR是一碳代谢途径的限速酶，主要参与叶酸的代谢和DNA的合成，同时在DNA的复制和修复中发挥着重要作用[13-14]，能不可逆地催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为 5-甲基四氢叶酸，因此MTHFR活性与叶酸代谢具有密切关联，进而影响NSCLC患者以铂类为基础的化疗疗效[15-16]。多项研究发现的近20个MTHFR基因突变位点中，C677T是研究较多的位点之一[17-18]。本研究结果中，180例NSCLC患者进行MTHFR C677T基因分型，CC基因型40例(22.22%)，CT基因型73例(40.56%)，TT基因型67例(37.22%)，入组病例具有一定的人群代表性，与既往文献报道相近[19-20]。

既往研究发现[21-22]，乳腺癌患者MTHFR C677T基因多态性中的TT型化疗有效率明显高于CC型，同时在CAF方案化疗组患者中MTHFR 基因 C677T 的 TT 型、CT 型患者的化疗有效率均明显高于CC型患者，可见MTHFR C677T基因多态性对指导乳腺癌患者个体化治疗具有重要价值。Pastorelli等[23]发现MTHFR C677T基因CC型患者较 TT型患者拥有更好的近期疗效。而但 Tiseo等[24]研究发现，MTHFR C677T 基因 TT 型患者拥有更长的总生存期。国内一项关于MTHFR C677T基因多态性与以培美曲塞为基础治疗晚期非小细胞肺癌疗效相关性的META分析中发现[25]，MTHFR C677T基因CC型的晚期NSCLC患者采用培美曲塞为基础化疗的客观缓解率较其他基因型更高。本研究结果中，MTHFR C677T基因型CC、CT、TT基因型中位生存时间分别为20个月、25个月、30个月，CC型中位生存时间明显低于CT/TT型，与Smit等[26]报道一致。同时本研究通过采用COX风险比例模型分析OS的独立影响因素，结果显示：在校正影响OS单因素分析结果中的年龄、性别、ECOG评分、组织学类型后，发现MTHFR C677T基因型CC是OS的独立影响因素，提示MTHFR C677T基因型CC是OS的独立危险因素，分析原因可能是此类突变的基因型MTHFR活性提高，造成叶酸代谢水平增加，进而导致以铂类药物的作用靶点增加，有助于提高疗效[27-28]。但考虑到本次研究均为亚洲人种，样本量较少，结果有待进一步探讨。

综上所述，MTHFR C677T基因型与以铂类为基础治疗的NSCLC疗效存在相关性，基因型CC是影响患者OS的独立危险因素，对接受以铂类为基础治疗的NSCLC患者的预后具有一定的临床指导意义。