二甲双胍对肺腺癌细胞Nrf2基因表达的调控作用研究

张甲翠 马和平 段晓晏 王佳宁

肺腺癌对铂类耐药是影响预后的主要问题，Keap1/Nrf2/ARE信号通路在铂类耐药中发挥重要作用[1]。在活性氧的刺激下，转录因子Nrf2[2]与Keap1解偶联，Nrf2入核结合于肌腱纤维瘤蛋白(sMaf)形成异二聚体后启动ARE靶基因转录[3]，启动超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧化酶-1(H0-1)、谷胱甘肽转移酶(GSH)等Ⅱ相解毒酶[4]转录，提高细胞抗氧化应激能力[5]，增强肿瘤细胞的代谢活动和生长，促进肿瘤增殖[6]；导致癌细胞凋亡减少，使肿瘤耐药作用加强[7-9]。ABCC1在MDR中发挥了非常重要的作用[10,11]，ABCCs常与II相解毒酶表达的调控具有协同作用[12-13]。Nrf2活性受MAPKs信号通路的调控[14,15]，但MAPKs直接磷酸化Nrf2，并不引起显著的Nrf2激活，且因不同肿瘤细胞而不同， Nrf2活化入核与磷酸化的ERK、JNK、p38形成二聚体，再激活Nrf2下游基因的转录[16]；不同机体脏器部位Nrf2基因激活的途径亦不同[17]。二甲双胍能降低糖尿病患者合并卵巢癌、肺癌、肝癌等肿瘤风险[18,19]；可通过调控细胞周期蛋白及其相关因子的表达,阻滞不同肿瘤细胞[20-22]于细胞G0/G1期或 G1/S期；亦可抑制不同病理类型的肺癌细胞增殖[23],并呈剂量依赖性，仅在小细胞癌细胞系中具有诱导细胞凋亡的作用。目前国内外对二甲双胍影响耐铂类肺腺癌细胞中Nrf2基因的表达的机制鲜有报道。本研究推测Nrf2/ARE信号通路在肺腺癌铂类耐药表达中发挥重要作用，这将有助于我们在源头上寻找多药耐药过程中的关键基因,为肿瘤的临床精准化疗提供理论依据和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人肺腺癌细胞株A549、A549/DDP(中国科学院上海生命科学院细胞库，上海)；RPMI 1640干粉培养基(Gibco公司)；胎牛血清为 Hyclon产品(上海鲁汶生物工程)；RNA反转录采用PrimeScript RTreagent Kit RR047A试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒采用SYBR PrimeScript (Perfect Real Time) RR086A试剂盒(TakaRa公司，大连)，二甲双胍(上海生工生物工程股份有限公司)；所有引物由上海博彩生物科技有限公司合成，见表1。

1.2 细胞培养

人肺腺癌细胞(A549 和A549/DDP)培养于10%胎牛血清(FBS)RPMI 1640中，含青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml)，在5%CO2，37 ℃饱和湿度的培养箱内培养。

1.3 方法

1.3.1 基因表达检测 A549和A549/DDP细胞接种于6孔板中，以1×105细胞/孔的密度培养24 h后收集细胞，根据说明书推荐的方法用Trizol试剂提取细胞总RNA，再转录成cDNA，用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒进行定量多聚酶链反应。在95 ℃，1 min，1个循环；95 ℃，5 s，40个循环；60 ℃，30 s，40个循环的条件下对反应液进行Real-time PCR扩增(Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，美国)，测定A549和A549/DDP细胞间GSTA1，HO-1，ABCC-1，Nrf-2,SOD基因表达水平；不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mM)刺激细胞4小时后，分别提取两株细胞RNA检测Nrf2、GSTA1和ABCC1基因水平变化。

1.3.2 Western Blot实验 A549、A549/DDP细胞培养后抽提总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，配胶后进行SDS-PAGE电泳，转膜并封闭，分别于4 ℃孵育不同抗体和内参抗体过夜，TBST分别洗涤膜3次后再孵育相应的二抗后，再用TBST洗涤膜3次，将PVDF膜正面向上铺于成像仪，用Bio-Rad ChemiDoc MP凝胶成像分析系统成像显影，蛋白谱带强度使用ImageJ软件分析。

1.3.3 细胞增殖实验(CCK-8)及凋亡检测 分别制备A549细胞和A549/DDP细胞悬液后接种96孔板，细胞密度为1×104cells/well，予二甲双胍(0、1、5、10 mM)共培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μl CCK8孵育4 h，用flexstation 3酶标仪(Molecular Devices公司，加利福尼亚，美国)在450 nm波长处测量并记录每孔中的吸光度；分别将A549、A549/DDP细胞接种于24孔板中，细胞密度为5×104cells/ml，经不同浓度二甲双胍作用24 h或48 h后，胰酶消化收集细胞，重悬于binding buffer中,加入5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl propidium iodide (PI),室温避光20 min，上机用流式细胞仪BD FACSAriaTM II flow cytometer (BD biosciences,California,USA)检测细胞凋亡率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 A549与A549/DDP细胞株间各耐药基因的基因和蛋白表达差异

前期经GSTA1、HO-1、ABCC1、ABCC-1、Nrf2、SOD基因水平筛选，对A549与A549/DDP细胞株进行基因表达检测，发现A549与A549/DDP细胞株的Nrf2、ABCC1 Mrp-1、GSTA1基因水平的表达有明显差异,通过Western Blot实验进行总蛋白和蛋白水平验证，发现结果与基因水平筛选一致(图1)。且在A549/DDP细胞株中的表达水平比A549显著增高,以上结果提示，Nrf2、ABCC-1、GSTA1在肺腺癌顺铂耐药细胞株表达水平比敏感株显著增高。

注： A549:人肺癌细胞；DDP:顺氯氨铂；Nrf2:核因子E2相关因子；GSTA1:谷胱甘肽S转移酶A1；ABCC1:药物转运蛋白；GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶。图1 A549与A549/DDP细胞株间各耐药基因在基因和蛋白表达差异

为了进一步明确不同浓度二甲双胍刺激后各耐药基因的变化情况。用不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mM)刺激A549和A549/DDP细胞株，4 h后提取RNA检测各基因水平变化，并通过Western Blot实验进行蛋白水平验证，发现随着二甲双胍浓度增高，A549细胞(图2A)和A549/DDP细胞株(图2B)的Nrf2、GSTA1和ABCC-1基因水平和蛋白水平的表达均逐步降低。结果提示二甲双胍能够明显抑制各耐药基因的表达。

图2 不同浓度二甲双胍影响A549、A549/DDP细胞间耐药基因在基因和蛋白水平表达差异

2.2 不同浓度二甲双胍对A549、A549/DDP细胞增殖抑制及凋亡的影响

对A549与A549/DDP细胞株均予以不同浓度二甲双胍(0、1、5、10 mM)刺激，进行细胞增殖实验及凋亡检测。 随着二甲双胍浓度增高，A549细胞增殖能力逐步减弱，尤其浓度为5 mM和10 mM时，增殖能力明显减弱(图3A)；而二甲双胍浓度为10 mM时，A549/DDP细胞增殖能力才能明显减弱(图3B)。且当二甲双胍浓度为5 mM和10 mM时，A549细胞48 h后凋亡率(图3E)较24 h凋亡率(图3C)明显升高，但相同条件下A549/DDP细胞(图3D、3F)凋亡率在48 h时较24 h仅轻度升高(P均<0.05)，提示二甲双胍诱导耐药细胞的凋亡率明显低于非耐药细胞，且作用的最佳时间点是48 h。

图3 不同浓度二甲双胍对A549、A549/DDP细胞增殖抑制及凋亡的影响

3 讨论

我们研究发现人肺腺癌A549、A549/DDP细胞Nrf2及下游抗氧化基因中Nrf2、GSTA1、ABCC-1基因蛋白水平存在显著性统计学差异(P均<0.01)。Nrf2可以在Nrf2诱导剂刺激下，通过与MRP2基因明确的ARE位点结合，提高ABCC2的表达[24]。而MRP1可以将GSTA1与抗癌药物形成GSH复合物泵出胞外[25-27]，阻碍细胞内抗癌药物与靶位点结合降低细胞内抗癌药物浓度，致肿瘤细胞产生耐药性[28,29]。下调耐顺铂的人肺腺癌细胞MRP表达后，对顺铂的耐药性显著降低[30]。GSTA1可能促进DNA的修复低[28];GSTA1可与铂或铂-DNA络合物结合，降低顺铂的毒性，促进肿瘤细胞解毒。应用GST抑制剂可以增强顺铂对耐药细胞株的细胞毒作用[31]。GSTs属于Ⅱ相共轭酶，它们能将有活性的亲电子代谢产物解毒，它们的效应依赖于谷胱甘肽的水平，后者取决于GCL和GSTA1合酶[32]。

二甲双胍可能主要通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ，小分子干扰RNA抑制AMPK的表达后，可逆转二甲双胍的抗肿瘤增殖作用[33-34]。本研究发现，二甲双胍能抑制肺腺癌A549细胞的增殖，促进其凋亡，并呈时间和浓度依赖性(P<0.01)，但对A549/DDP细胞，仅在高浓度二甲双胍时显示前述作用(P<0.05)。经二甲双胍刺激，A549、A549/DDP细胞GSTA1、ABCC-1、Nrf2基因、蛋白水平表达存在差异(P均<0.05)，我们研究进一步印证了二甲双胍抗肿瘤效应。