miR-181c-5p靶向TRIM71调控非小细胞肺癌细胞A549的凋亡研究

边红芝 韩俊垒 胡建平 丁成智

肺癌是癌症相关死亡率的主要原因，其5年生存率一直很差[1]。尽管监测和临床治疗策略有所改善，但美国的5年总生存率仍约为16%[2]。2012年，全世界有180万人罹患肺癌，导致160万人死亡。不幸的是，其总发病率在世界范围内急剧增加[3]。大多数肺癌临床病例分为两种亚型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)[4]。大约70%的新诊断为肺癌亚型的患者在切除后出现局部复发或转移性病变[5]。毫无疑问，阐明肺癌的发病机理对于有效治疗该疾病很重要。MicroRNA(miRNA)是一类短的，内源性的非编码RNA，可调节基因表达[6]。尽管miRNA仅占表达基因组的一小部分，但已证明它们在各种细胞过程中具有重要作用，包括增殖，凋亡，分化和恶性转化[7]。据估计，有60%的基因受miRNA调控，miRNA表达的变化会影响生理和病理过程[8]。已有研究发现肺癌组织和正常肺组织的miRNA表达差异极大，并且已经鉴定出一些在肺癌发生和发展中具有关键功能的miRNA[9]。然而，仍然有许多miRNA的功能亟待剖析，包括miR-181c-5p。基于此，本研究旨在探讨miR-181c-5p调控非小细胞肺癌细胞A549的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

HLF-a(人肺细胞)和非小细胞肺癌细胞A549均购自procell(货号：CL-0359、CL-0016)。miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor、siRNA均由吉凯基因合成。TRIM71的过表达载体由A549 cDNA扩增片段后连接至PCDNA3.1载体上。RevertAidHMinus第一链cDNA合成试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(货号：TER016-1)。SYBR Green PCR Master Mix购自广州一科生物科技有限公司(货号：RBWG5-10 ml,400T)。pmiR-RB-REPORTTM载体购自锐博生物。RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司(货号：P0013B)。Lipofectamine 3000购自上海齐正生物科技有限公司(货号：L3000008)。泛素蛋白酶体抑制剂MG132购自selleck(货号：S2619)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 HLF-a使用MEM培养基(补充有10%胎牛血清和1%双抗)培养，A549使用DMEM培养基(补充有10%胎牛血清和1%双抗)培养。miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor、siRNA和质粒均用Lipofectamine 3000转染。泛素蛋白酶体抑制剂MG132的使用终浓度为20 μM。

1.2.2 RNA抽取与实时荧光定量PCR 按照制造商的说明，使用Trizol试剂提取总RNA。通过分光光度法定量后，使用1 μg总RNA通过RevertAidHMinus第一链cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在Applied Bio-system 7500仪器上进行实时PCR分析。所有反应均按照以下程序进行：95 ℃ 3 min，在95 ℃下进行42个循环30 s，在60 ℃下进行30 s退火，并在72 ℃下延伸40 s。用2-△△CT法计算靶基因的相对表达。使用U6或GAPDH作为内部对照对CT值进行标准化。特异性引物如下：miR-181c-5p，(正向)5-GGGAACATTCAACCTGTCG-3和(反向)5-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3；U6，(正向)5-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3和(反向)5-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3；GAPDH，(正向)5-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3和(反向)5-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3。

1.2.3 免疫印迹 将肿瘤组织或细胞在冰冷的磷酸盐缓冲液中冲洗，并在RIPA裂解缓冲液中裂解以收集蛋白质。将样品以12000 g离心20 min，并通过BCA蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度。等量的蛋白质在12%SDS-PAGE上电泳，并转移到PVDF膜上。然后在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1小时。随后，将膜与一抗(TRIM71,p53,GAPDH)，然后与结合HRP的二抗用于检测蛋白质-抗体复合物。GAPDH用作对照蛋白以定量相关蛋白的表达。

1.2.4 荧光素酶报告实验 通过插入TRIM71 mRNA的3-UTR片段来构建pmiR-RB-REPORTTM载体，该片段包含推定的miR-181c-5p结合位点。 作为突变载体，TRIM71的3-UTR片段的种子结合位点发生了突变，从TGAATGT到ACTTACT。为了进行报告基因分析，使用Lipofectamine 3000将100 ng野生型或突变质粒和50 μnM miR-181c-5p mimics或阴性对照转染293T细胞。转染后24小时使用Dual-GloTM荧光素酶测定系统测量萤火虫和海肾荧光素酶的活性。

1.3 统计学分析

本研究应用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有实验一式两份进行，并重复至少三遍。组间差异通过t检验进行评估，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-181c-5p促进非小细胞肺癌细胞A549的凋亡

miR-181c-5p在非小细胞肺癌细胞A549中的表达水平低于人正常肺细胞HLF-a(P<0.05)，见图1A。转染miR-181c-5p mimics过表达miR-181c-5p后，发现非小细胞肺癌细胞A549的凋亡上升(P<0.05)；转染miR-181c-5p inhibitor敲低miR-181c-5p后，发现非小细胞肺癌细胞A549的凋亡下降(P<0.05)，见图1B。

图1 miR-181c-5p促进非小细胞肺癌细胞A549的凋亡

2.2 miR-181c-5p靶向TRIM71

通过miRDB在线分析，发现miR-181c-5p潜在靶向74个基因。基于此，在A549细胞中过表达miR-181c-5p后，通过实时荧光定量PCR发现有15个基因的表达水平被调节了6倍以上(P<0.05)，见图2A。通过siRNA敲低上述15个基因后，发现当敲低TRIM71时，非小细胞肺癌细胞A549的凋亡水平上升(P<0.05)，见图2B。过表达TRIM71后，非小细胞肺癌细胞A549的凋亡水平下降(P<0.05)，见图2C。过表达miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平下降；而敲低miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平上升，见图2E和图2F。此外，miR-181c-5p靶向TRIM71 mRNA的3端非编码区(P<0.05)，见图2D。

图2 miR-181c-5p靶向TRIM71

2.3 miR-181c-5p抑制TRIM71泛素化P53

敲低TRIM71后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平上升；而过表达TRIM71后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平下降，见图3A和图3B。过表达miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平上升；而敲低miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平下降，见图3C和图3D。泛素蛋白酶体抑制剂MG132处理后，过表达miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平没有明显变化；敲低miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平没有明显变化，见图3E和图3F。

图3 miR-181c-5p抑制TRIM71泛素化p53

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，并且仍然是全球癌症相关死亡的主要原因[10]。尽管有诸如靶向治疗等巨大成就，但是，找到一种彻底治愈肺癌的方法仍然是一个挑战。肿瘤的发展是一个复杂而复杂的过程，可能会受到环境或个人因素的影响。尽管已经广泛研究了与肿瘤相关的致癌因素，但促成肿瘤发生的潜在机制仍然难以捉摸。因此，确定此类机制至关重要。

miRNA是一类小的非编码RNA，参与多个细胞生物学过程，包括上皮到间质转化、凋亡、增殖、侵袭和转移[11]。miRNA通过与目标mRNA的3'非翻译区(UTR)结合来调节转录后水平来抑制基因[12]。新兴证据表明，可以通过抑制或过表达某些miRNA的水平来在体外或体内调节癌症的发展[13]。因此，miRNA可能成为有希望的癌症治疗靶点。在本研究中，miR-181c-5p在非小细胞肺癌细胞A549中的表达水平低于人正常肺细胞HLF-a(P<0.05)。过表达miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的凋亡上升(P<0.05)；敲低miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的凋亡下降(P<0.05)。已有研究表明miR-181c-5p的过表达加剧了缺氧诱导的心肌细胞损伤，并加剧了缺氧诱导的心肌细胞凋亡[14]。本研究并未给予A549细胞缺氧条件，但是miR-181c-5p依旧促进了凋亡，提示miR-181c-5p在肿瘤细胞和心肌细胞中的促凋亡机制并不相同。miR-181家族包含四个miRNA(miR-181a，miR-181b，miR-181c和miR-181d)，它们被发现具有高度同源性，并在体内广泛分布[15]。除了miR-181c-5p，miR-181家族的其他是否也与细胞凋亡相关仍然值得探讨。

miRDB在线分析发现miR-181c-5p潜在靶向74个基因。过表达miR-181c-5p后，发现有15个基因的表达水平被调节了6倍以上(P<0.05)。敲低上述15个基因后，发现当敲低TRIM71时，非小细胞肺癌细胞A549的凋亡水平上升(P<0.05)。过表达TRIM71后，非小细胞肺癌细胞A549的凋亡水平下降(P<0.05)。过表达miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平下降；而敲低miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平上升。此外，miR-181c-5p靶向TRIM71 mRNA的3端非编码区(P<0.05)。TRIM71是Trim-NHL蛋白家族的成员[16]。已有研究发现TRIM71能够通过泛素化降解p53[17]。因此，A549细胞可能存在miR-181c-5p/TRIM71/p53调控轴以促进细胞凋亡。在本研究中，敲低TRIM71后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平上升；而过表达TRIM71后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平下降。过表达miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平上升；而敲低miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平下降。泛素蛋白酶体抑制剂MG132处理并过表达miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平没有明显变化；泛素蛋白酶体抑制剂MG132处理并敲低miR-181c-5p后，非小细胞肺癌细胞A549的p53水平没有明显变化。由p53诱导的凋亡被牢固地确立为肿瘤抑制的主要机制[18]。除了其作为核转录因子的复杂功能外，p53还可以在细胞溶质和线粒体中发挥作用，通过不依赖转录的机制促进细胞凋亡。

综上所述，miR-181c-5p通过靶向TRIM71 mRNA的3端非编码区后减少了TRIM71的表达水平，随后凋亡活化基因p53的蛋白水平上升，最后促进了非小细胞肺癌细胞A549的凋亡。