两株锈菌重寄生菌毒素的分离鉴定及活性研究

李 靖，谢 津，孔 磊，张登云，隋国强，陈玉惠

(1.西南林业大学 生命科学学院，昆明 650224；2.中国科学院昆明植物研究所 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，昆明 650204)

植物锈病危害严重，对大多数农作物都有危害，可造成感病品种大面积减产[1-2]。林木锈病同样危害严重，如在四川、云南、陕西等地发病面积较大的华山松疱锈病，是由茶藨生柱锈菌(Cronartiumribicola)引起的一种毁灭性松干锈病，对西部林业发展及生态环境建设造成了严重的威胁[3]。由文山锈孢锈菌(Aecidiumwenshanense)引起的石楠叶锈病自然发病率较高，严重影响石楠的绿化和观赏价值，已经成为西南地区最重要的苗圃病害之一[4]。

国内外已有大量的研究证实锈菌重寄生现象在自然界中非常常见[5-6]，利用重寄生菌的自然调控作用来控制病原菌，是有效防治植物病害的新途径。所以当前植物锈病生物防治的研究重点集中在对锈菌重寄生菌的研究上[7-8]。在筛选对锈孢子具破坏作用的重寄生菌过程中，虽然获得了一些具有较好的生防应用前景的菌株，但直接应用其控制植物锈病面临很多现实的问题[9-11]，因而重寄生菌-寄主菌互作机制成为锈菌生物防治的研究热点。对重寄生的机制研究主要包括酶和毒素两方面，目前关于胞壁降解酶的研究较为深入[12-13]，而毒素的研究仅限于粗提物[14-15]。

拟盘多毛孢PG52菌株和康宁木霉8662菌株是石楠叶锈病菌及茶藨生柱锈菌的重寄生菌，前期研究结果显示小分子次级代谢产物——毒素分子可能在其重寄生过程中发挥重要作用[16-18]。本研究采用活性追踪的方法，对两株重寄生菌所产毒素进行分离纯化和结构鉴定，研究结果为生物农药的开发和从化学层面阐明重寄生的机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

PG52菌株分离自石楠叶锈病菌感病叶片，康宁木霉8662菌株分离自华山松疱锈菌感病枝干[16-18]，菌株均保存在西南林业大学生物化学教研室。

1.2 方法

1.2.1 两株重寄生菌毒素的分离

根据前期实验结果，PG52菌株的最佳产毒培养基为改良Fries培养基，康宁木霉8662最佳产毒培养基为PDA固体培养基[17-18]。

改良Fries培养基：KH2PO41 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaCl 0.1 g, CaCl2·2H2O 0.13 g, 蔗糖 20 g,酒石酸铵 5 g, 酵母浸膏 1 g, NH4NO31 g, 蒸馏水 1 000 mL, 琼脂 15～20 g, pH自然。

PDA固体培养基：土豆 200 g, 葡萄糖 20 g, 蒸馏水1 000 mL, 琼脂 15～20 g, pH自然。

PG52菌株经改良Fries固体培养基发酵30 L，室温下培养21 d。将已发酵好的固体培养基连同其上的菌落一同切为细小块状，用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=80∶15∶5(体积比)混合溶剂提取3次，乙酸乙酯萃取至无色，用旋转蒸发仪45 ℃减压浓缩至干，得浸膏并称重。

康宁木霉8662用PDA培养基发酵20 L, 室温下培养20 d。提取方法同上，得浸膏并称重。

采用柱层析和高效液相色谱分离相结合，对其次生代谢产物进行系统分离纯化，通过薄层层析和高效液相色谱对所得物质进行纯度检验。

1.2.2 毒素结构的鉴定

对分离得到的纯化合物进行 NMR 测定以及高分辨质谱测定。得到谱图后，通过对谱图的数据整理及相关文献查阅进行化合物结构解析。

1.2.3 毒素对锈孢子的抑制作用

取分析纯3-硝基丙酸和柠檬酸，配制不同质量浓度的3-硝基丙酸(1、5、10、100和400 μg/mL)和柠檬酸(50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL、1 mg/mL和5 mg/mL)分别处理茶藨生柱锈菌的锈孢子1 h，台盼蓝染色0.5 h后显微观察，计算锈孢子致死率，以蒸馏水处理的锈孢子作为对照。

1.2.4 毒素对锈菌孢子的作用

用500 μg/mL的柠檬酸分别处理石楠叶锈(Aecidiumwenshanense)锈孢子、竹杆锈(Sterostratumcorticioides)冬孢子和三叶草叶锈(Uromycestrifolii)夏孢子，通过台盼蓝染色观察毒素对其他锈菌孢子的致死作用。

2 结果与分析

2.1 两株重寄生菌毒素的分离

PG52菌株：将乙酸乙酯萃取后所得的浸膏(21.633 g)用约30 mL氯仿∶甲醇(1∶1)溶解后，用硅胶(100～200目，40 g)拌样，经正相柱层析(200～300目，250 g)，用石油醚∶乙酸乙酯=(10∶1、8∶2、7∶3、6∶4)，氯仿∶甲醇=(10∶1、8∶2)，甲醇系统洗脱，经TLC(薄层色谱，Thin Layer Chromatography)检测，将含有相同Rf值(比移值)和显色情况化合物的组分合并，分别减压浓缩至干，共分为10个组分：Fr.1～Fr.10。经锈孢子活性测试及台盼蓝染色确定拟盘多毛孢PG52活性成分在Fr.4。Fr.4经Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇=1∶1)分离后得到3个组分，分别为Fr.4.1～Fr.4.3。其中Fr.4.1用硅胶(100～200目)拌样后，洗脱柱填装为GF254硅胶，用石油醚-丙酮(8∶1、8∶2)进行梯度洗脱，得到无色针状结晶(28.4 mg)。

8662菌株：将乙酸乙酯萃取后所得的浸膏(30 g)用约30 mL氯仿∶甲醇(1∶1)溶解后，用硅胶(100～200目, 35 g)拌样，经正相柱层析(200～300目, 120 g)，用石油醚∶乙酸乙酯=(10∶1、8∶2、7∶3、6∶4)，氯仿∶甲醇=(10∶1、8∶2、7∶3、6∶4)，甲醇系统洗脱，分别减压浓缩至干，经TLC层析检测，将含有相同Rf值和显色情况化合物的组分合并在一起，共分为7个组分：Fr.1～Fr.7。经锈孢子活性测试及台盼蓝染色确定康宁木霉8662活性部分在Fr.5，通过前期的分离将含活性的部分合并后得Fr.5～Fr.9(m=0.458 g)，Fr.5～Fr.9经过LC3000高效液相色谱仪在H2O/MeOH(70%/30%)梯度下分离30 min，按时间顺序接收样品并进行活性检测后得活性部分Fr.5-9-2，Fr.5-9-2经过Sephadex LH-20凝胶, 用 CDCl3/MeOH(1∶1)洗脱后得到活性化合物。

2.2 两株重寄生菌毒素的结构鉴定

经分离鉴定，拟盘多毛孢菌株PG52所产毒素为活性化合物：C3H5NO4，无色晶体；ESI-MS(m/z: 118[M-H]-)；1H-NMR(CD3OD, 400 MHz)δH: 4.68(2H, m), 2.96(2H, m);13C-NMR(CD3OD, 100 MHz)δC:173.5(s, C-3), 71.0(t, C-1), 31.7(t, C-2)。经文献[19]对比后确定上述活性化合物均为3-硝基丙酸(图1)。

图1 毒素(3-硝基丙酸)的分子结构

经分离鉴定，康宁木霉菌株8662所产毒素为活性化合物：C6H8O7，无色针状结晶。ESI-MS(m/z: 191[M-H]-)；13C-NMR谱中仅见4种碳信号，δC176.8和173.5处的季碳信号均为羧基上的羰基碳信号，前者为1个碳原子信号，后者为化学位移值相同的2个碳原子信号。δC74.2处为1个季碳信号，其化学位移值表明该碳原子上应连有含氧基团。另1个碳信号为δc43.9(CH2)处的2个亚甲基碳的信号。1H-NMR谱中可观察到4个质子，即δ 2.73(2H, d,J=15.5 Hz)和2.85(2H, d,J=15.5 Hz)处的质子信号，由其偶合常数(J=15.5 Hz)可知这 4 个质子分别为 2 个亚甲基上的质子信号(CH2)。从其化学位移值可知，这 2 个 CH2上的质子均受到去屏蔽作用，即分别与 1 个羰基相连。结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT谱参考文献[20]，鉴定该化合物为2-羟基-1、2、3-丙烷三羧酸，即柠檬酸(图2)。

图2 毒素(柠檬酸)的分子结构

2.3 毒素对茶藨生柱锈菌锈孢子的抑制作用

两种毒素分子对茶藨生柱锈菌的锈孢子均有致死作用，能使锈孢子膜的通透性发生改变，内含物外溢，台盼蓝染色证实锈孢子死亡，与重寄生过程中观察到的现象一致。图3显示作用后的锈孢子经台盼蓝染色变蓝，和对照相比，被作用的锈孢子(深蓝色)明显变小。

(a)(c)为对照；(b)100 μg/mL柠檬酸处理1 h，经台盼蓝染色的锈孢子；(d)10 μg/mL的3-硝基丙酸处理1 h，经台盼蓝染色的锈孢子。

不同浓度的毒素分子对茶藨生柱锈菌锈孢子的致死率存在差异。用100 μg/mL的柠檬酸处理1 h，锈孢子的致死率达到50%；当柠檬酸的质量浓度达到500 μg/mL时，锈孢子的致死率达到90%(图4)。用10 μg/mL的3-硝基丙酸处理1 h，锈孢子的致死率达到50%。

图4 柠檬酸对茶藨生锈菌锈孢子的作用

2.4 柠檬酸对其他锈菌孢子的作用

用500 μg/mL的柠檬酸处理竹杆锈(Sterostratumcorticioides)的冬孢子、石楠叶锈(Aecidiumpourthiaea)的锈孢子和三叶草叶锈(Uromycestrifolii)的夏孢子1 h，发现其对3种孢子均有较强的致死作用，被作用的孢子经台盼蓝染色变蓝(图5)。

(a)(c)(e)为对照；(b)被作用的三叶草叶锈的夏孢子，经台盼蓝染色变蓝；(d)被作用的石楠叶锈菌的锈孢子；(f)被作用的竹杆锈的冬孢子。

3 讨论与结论

研究采用活性追踪并结合传统天然产物化学的分离方法，从两株重寄生菌中分离纯化并鉴定了毒素分子——3-硝基丙酸和柠檬酸，这是首次从锈菌的重寄生菌中分离获得的对林木锈菌锈孢子具有致死作用的活性化合物，该化合物能使锈孢子内含物外溢，与对照相比，锈孢子明显变小，与重寄生过程中观察到的现象一致。3-硝基丙酸是简单的有机酸化合物，是曲霉属和青霉属的少数菌种产生的次级代谢产物，在某些高等植物中也有。变质甘蔗中的3-硝基丙酸可使人中毒，病人主要表现为中枢神经系统损害[21]。柠檬酸为三羧酸循环的中间产物，对植物体无毒，对环境也不会造成危害，成本低廉易得，对其他锈菌孢子也具有较好的作用效果，因此具有较好的应用前景。

此次分离获得的毒素分子均为小分子有机酸化合物，其对锈孢子的破坏作用是否为低pH值所致，进行了相关对照实验，发现当柠檬酸的质量浓度为100 μg/mL时，锈孢子的致死率达到50%，为半致死剂量，此时溶液的pH值接近4.0，此pH值条件下的HCl溶液并未对锈菌孢子有明显的破坏作用。因此认为在一定质量浓度范围内，对锈孢子的破坏作用主要与毒素分子本身有关。

在利用毒素分子处理锈孢子时发现，由于锈孢子本身具有疏水性，锈孢子在水溶液中的分散度不高，利用振荡器提高其分散度，毒素对锈孢子的致死作用效果较明显，但在野外试验中还很难解决上述问题。在今后的试验中，将寻找有效的溶剂或者表面活性剂，增强毒素分子和锈孢子之间的相互作用。