新疆柳树叶锈病栅锈菌的形态学特征及系统学分析

王丽丽,李克梅,王金铭,努尔斯曼姑丽艾海提,田呈明

(1.北京林业大学/省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,北京100083;2.新疆农业大学 农学院/农林有害生物监测与安全防控重点实验室,乌鲁木齐830052)

柳树是重要的用材和造林绿化树种,作为快速生长的木本主要生物质来源,在生态修复、装饰材料、纤维生产等方面应用广泛。新疆柳树资源丰富,约有50种(变种)分布于高山、平原、河岸、沙丘、极地等多种生境,甚至有些种是耐旱、寒以及盐碱等抗逆性强的种类[1]。

柳树叶锈病发生于叶部,是一类危害柳树健康生长的重要生物灾害之一。柳树整株染病后,会在正常秋叶脱落前六周或更长的时间内大量提前落叶,易导致树势衰弱而诱发其他病虫害,尤其是对苗期及幼树危害更大,降低成活率[1],造成经济损失。

柳树叶锈病病原种类较多,均属担子菌门(Basidiomycota)、锈菌目(Pucciniales)、栅锈菌科(Melampsoraceae)、栅锈菌属(MelampsoraCast)。栅锈菌大都属于专性寄生,与寄主关系密切,除少数种同主寄生于大戟科(Euphorbiaceae)、亚麻科(Linaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)和金丝桃科(Hypericaceae)外,多数栅锈菌种为转主寄生,即夏孢子和冬孢子阶段生于杨柳科(Salicaceae),而性孢子和锈孢子阶段寄生于冷杉属(Abies)、葱属(Allium)、卫矛属(Euonymus)、落叶松属(Larix)、红门兰属(Orchis)、茶藨子属(Ribes)、虎耳草属(Saxifraga)、堇菜属(Viola)等植物上[1-2]。

迄今为止,国内外已报道栅锈菌属内有效种约100种,其中,超过50种寄生于杨柳科植物,而寄生于该科内柳属(Salix)的栅锈菌数量最多,约40余种,国内34种[2-10]。在新疆,经传统形态分类学研究报道了4种柳属栅锈菌[8]。近十年,Zhao等[6-7]采用DNA内部转录间隔(ITS)、大亚基(LSU)等的分子系统发育研究与形态学相结合,对国内柳属栅锈菌进行深入研究,并报道来自新疆柳属的栅锈菌新种、国内新记录种和新疆新记录种各1种。笔者在2020年报道新种和新疆新记录种各1种[9]。在传统栅锈菌分类中以冬孢子形态、夏孢子形态、寄主与转主寄主种类作为主要鉴定依据,然而,冬孢子有时在种间差异不明显,有时甚至不产生,反而是夏孢子产生并存活时间最长。目前,许多国内外学者研究栅锈菌分类发现,夏孢子形状、表面刺突、侧丝特征在种间具有明显差异,常被用于分种的主要依据,促使栅锈菌分类体系得到进一步补充完善。

笔者近几年在新疆各地广泛采集锈菌标本时发现,本地区柳树叶锈病普遍发生,其病原栅锈菌种类、寄主范围、分布地点都较以往有所不同。本文利用现代真菌分类学技术,对新疆柳属叶锈病栅锈菌物种、寄主及分布开展研究,为新疆菌物分类及多样性研究提供标本和基础数据,为林木病害诊断与防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2012—2016年,于新疆维吾尔自治区阿勒泰、塔城、伊犁、乌鲁木齐、昌吉、阿克苏、库尔勒、和田等地州,山地、平原、牧场、河岸、荒漠、农田及城市绿化地等生境采集柳属叶锈病标本,标本保存于新疆农业大学菌物标本室(HMAAC)。

1.2 形态学观察及系统发育分析

1.2.1 形态学观察 利用实体显微镜、光学显微镜和扫描电镜对栅锈菌夏孢子及冬孢子阶段的形态特征进行拍照、测量及描述,显微镜检以乳酚油作浮载剂[10]。夏孢子阶段特征观察:夏孢子堆叶面着生位置,夏孢子形态、大小、壁厚度、表面是否具有光滑区、刺间距、芽孔的数量及位置,侧丝形状、大小、壁厚度、着生位置。冬孢子阶段特征观察:冬孢子堆叶面着生位置,冬孢子着生位置,冬孢子形状、大小、壁厚度。

1.2.2 分子系统发育分析 DNA提取主要参考玻片研磨法[11];选用ITS和LSU两个基因片段进行系统发育分析,二者扩增引物为ITS1F和ITS4、NL1和NL4[12]。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,于4℃保存。从最新文献和GenBank中筛选已知柳属栅锈菌和外群落叶松杨栅锈菌(M.laricis-populina)的基因序列,利用RaxmlGUI1.3软件的最大似然法(ML)和MrBayes v.3.1.2软件的贝叶斯分析(BI)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 种类鉴定及检索表

经对45份柳属栅锈菌标本进行主要形态特征研究(图1、表1),共鉴定出9种栅锈菌,其中,米黄柳栅锈菌(M.asalicis-michelsonii)为国内外首次发现的种,在菌名前标识##符号,表示为新种;为新疆首次发现的有3种,扁桃栅锈菌(M.amygdalinae)、云南柳栅锈菌(M.salicis-cavaleriei)和中国黄花柳栅锈菌(M.salicis-sinicae),标识#符号,表示为新疆锈菌新记录种。其余5种均为新疆已知种,北极栅锈菌(M.arctica)、伊朗栅锈菌(M.iranica)、松柳栅锈菌(M.larici-epitea)、白柳栅锈菌(M.salicis-albae)、银柳栅锈菌(M.salicis-argyraceae)。寄主范围共涉及柳属内14种,其中,蓝叶柳(S.capusii)等8种在国内外报道的柳属栅锈菌寄主范围内属首次出现,其名称前标识*符号,表示为该锈菌的寄主新记录(表2)。

表1 新疆柳属叶锈栅锈菌的夏、冬孢子堆阶段形态特征Table1 Uredinia and telia morphological characteristics of Melampsora species on Salix in Xinjiang

表2 新疆柳属叶锈栅锈菌的寄主范围及分布Table2 Hosts and distribution of Melam psora species on Salix in Xinjiang

本文对9种新疆柳树栅锈菌制定平行式形态分类检索表,以供相关病原种类鉴定研究参考。检索表如下。

1.夏孢子通常为长椭圆形至卵形 …………2

1.夏孢子通常为球形、卵形至宽椭圆形…4

2.夏孢子堆仅叶正面生…………………………………………#M.salicis-cavaleriei

2.夏孢子堆叶背面生或叶两面生 …………3

3.单主寄生,夏孢子堆叶背面生,极少叶正面生……………………………#M.amygdalinae

3.转主寄生,夏孢子堆叶两面生,叶背面生为主………………………………M.salicis-albae

4.冬孢子角质层下生或表皮层及角质层下生,夏孢子堆叶背面生 ……#M.salicis-sinicae

4.冬孢子表皮层下生 ………………………5

5.夏孢子堆叶两面生 ………………………6

5.夏孢子堆叶背面生 ………………………8

6.夏孢子堆叶正面生为主 ……M.iranica

6.夏孢子堆叶背面生为主 …………………7

7.冬孢子堆叶两面生,叶正面生为主…………………………##M.salicis-michelsonii

7.冬孢子堆叶两面生,叶背面生为主……………………………………………M.arctica

8.冬孢子顶端不增厚 ……M.larici-epitea

8.冬孢子顶端增厚…………………………………………………M.salicis-argyraceae

2.2 系统发育分析

本次系统发育研究获得ITS和LSU序列长度约分别为560 bp和570 bp,经构建ML和贝叶斯系统发育树,二者相对应的拓扑结构以及分析结果一致(图2)。M.amygdalinae(支持率98/0.96)、M.iranica(79/0.85)、M.larici-epitea(88/0.93)、M.salicis-albae(99/1)和M.salicis-argyraceae(88/0.98)分别与相应已知种具有较密切的亲缘关系而聚于同一分支,这5种栅锈菌的形态学鉴定与系统发育分析结果具有一致性,充分说明ITS和LSU序列信息在其种间具有明显差异。

但在系统发育树顶端M.arctica、M.salicissinicae和M.abietis-caprearum却汇聚在一起,就形态特征而言,它们都具有形态极为相似的夏孢子,即个体均较小,为球形或宽椭圆形,这可能是三者在系统发育树上处于同一类群的主要原因。但M.arctica夏孢子堆可叶两面生,以叶背面生为主,而M.salicis-sinicae和M.abietis-caprearum夏孢子堆仅在叶背面生。此外,M.arctica冬孢子大小为55～60×17～24μm,顶端未增厚[2-3],M.salicis-sinicae冬孢子为39～86×10～26μm,较长而窄,顶端增厚[4],而M.abietis-caprearum冬孢子偏狭小为19～30×9～12 μm,顶端不增厚[2],特此区分为3个种。由此说明ITS和LSU基因信息在这3种之间的种间差异过小无法区分,需通过结合形态学差异来区别。此外,在系统发育树中,M.salicis-cavaleriei和M.salicis-michelsonii均未与任何已知种汇合,而是分别形成的独立分支,说明二者均为独立的种,结合比较形态特征的差异,后者已作为新种被发表[9]。前者的相关报道极少,唯一模式标本因难以提取DNA至今仅有形态描述[10,23],但依据文献,M.salicis-cavaleriei是所有已知柳属栅锈菌中唯一夏孢子堆仅叶正面生的物种。本研究中该标本的夏孢子堆恰是仅叶正面着生,此外,夏孢子、侧丝和冬孢子的形态均与该已知种形态描述一致,特此鉴定为本种。

3 讨论与结论

3.1 新疆柳属叶锈病栅锈菌物种组成

本研究从14种柳属植物叶部共发现9种栅锈菌,包括1个新种M.salicis-michelsonii和3个新疆新记录种M.amygdalinae、M.saliciscavaleriei和M.salicis-sinicae,M.salicis-argyraceae等5种新疆已知种。其中,M.salicis-cavaleriei、M.salicis-sinicae、M.salicis-michelsonii和M.salicis-argyraceae均只分布于中国,为中国特有种,且后二者在国内仅分布于新疆,又为新疆特有种[4,7,9-10]。

M.amygdalinae是柳属上唯一报道的单主寄生栅锈菌[2],本研究采集该种标本时仅形成夏孢子阶段,因此,已结束的性孢子和锈孢子以及还未形成的冬孢子阶段均未能见到。M.saliciscavaleriei为中国云南特有种,本次研究发现该种在新疆也有分布,经系统发育研究后,首次报道了该种的ITS和LSU片段核酸信息。

据新疆柳属叶锈病栅锈菌以往的报道,还有个别种在本次研究中未发现,如M.capraearum、M.epitea和M.ribesii-viminalis[10],原因在 于本次标本采集地还不足够广泛,在今后的研究工作中,还有待于扩大调查继续补充。至此,新疆柳属叶锈病栅锈菌的种类共有12种,充分体现新疆锈菌物种具有丰富的多样性。

3.2 新疆柳属叶锈病栅锈菌寄主范围特点

在寄主植物种类及数量方面,文献报道M.arctica和M.larici-epitea广泛分布国内外,其寄主范围较广。在本研究中,二者侵染柳树种类较多,分别为4种、各占本次寄主种类总数的29%,亦体现其寄主范围较广。2014年报道的新种M.salicis-sinicae相关文献少,在本次研究中可侵染5种不同柳树,占比达到36%,体现该种寄主范围较广。M.salicis-albae为世界广布种,但从文献与本研究结果(标本数量10份)发现,该种只侵染S.alba一种寄主,寄主范围单一说明该菌专性寄生性较强。其次,寄主S.argyracea(9份)和(8份)均可被3种不同栅锈菌侵染,二者和S.alba的标本数量共占标本总数的60%,是最易被栅锈菌侵染的柳属树种。此外,研究结果发现,有8种柳属植物新增为锈菌寄主新记录,大大扩增了栅锈菌寄主范围。本文因缺少栅锈菌性孢子器和锈孢子器寄生的标本,未能对其转主寄主进行相关研究,还有待日后完善,仅在文中提供文献记载的相关信息以供参考(表3)。

表3 新疆柳属叶锈栅锈菌的性、锈孢子器阶段形态特征Table3 Spermogonia and aecia morphological characteristics of Melampsora species on leave of Salix

3.3 新疆柳属叶锈病栅锈菌地理分布特点

就地理分布及生境而言,本研究柳属栅锈菌在山地、平原、牧场、河岸、荒漠、农田及城市绿化地等多个生境均有不同分布。其中,分布于沙漠的物种最少,仅M.salicis-michelsonii(1份)为典型荒漠真菌;分布于山地物种最多,M.salicissinicae(14份)、M.salicis-argyraceae(4份)、M.iranica(2份)和M.salicis-cavaleriei(2份)分布于天山,M.amygdalinae(1份)分布于阿尔泰山,共5种23份标本合占本次研究总栅锈菌物种数和标本数的一半,可见山地是其优势分布生境。

本文只是柳属叶锈病栅锈菌一阶段性报道,科研工作者还需要更多、更深入的野外调查以及采用更先进的分类技术去探索新疆菌物多样性,相信还有许多未知物种或类群有待被发现。

致 谢:承蒙新疆农业大学草环学院周桂玲教授和林园学院王兵副教授在寄主植物鉴定方面给予的帮助,在此表示诚挚的感谢!