蝎毒素抗菌肽La39的序列分析及功能鉴定

朱晨刚，贾 庭

(1.贵州师范学院 生物科学学院，贵阳 550018；2.武汉大学 生命科学学院，武汉 430072)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物体抵御微生物入侵的一道防线，广泛存在于各个物种中，包括单细胞生物[1]、昆虫[2]、植物[3]、动物[4]、人体[5]。抗菌肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、寄生虫甚至病毒都有抑制杀灭作用[2]。不同于传统抗生素(如青霉素、卡那霉素)，病原菌很难对抗菌肽产生耐药性。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)被认为是最具威胁的病原体之一，体内外研究表明抗菌肽能够有效灭杀耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[6]。抗菌肽具有广谱抗菌活性以及低诱导耐药性的特点，使其成为一类很有吸引力的活性物质，应用于开发抗微生物治疗剂。

蝎子是地球上最古老的动物之一，已经延续了4亿多年[7]。在进化过程中，蝎子外形几乎没有变化。这可能是由于蝎子具有一套有效的毒液系统，该系统可以很好地支撑它们对捕猎和防御的需求。蝎子毒液含有多种生物活性成分，是药物设计开发的天然资源库，成分包括各种神经毒素，具有调节细胞膜上离子通道活性的功能，如Na+、K+、Cl-以及Ca2+通道毒素[8-9]。转录组和蛋白组研究发现蝎毒液混合物，除神经毒素外还有一些新型的多肽和蛋白质，如细胞裂解肽、胰蛋白酶抑制剂类多肽，同时也发现了多种抗菌肽，如Hadrurin[10]、scorpine[11]、BmKn2[12]、IsCTs[13]、Ctriporin[14]、StCTs[15]、Hp1404[16]和UyCTs[17]。

研究从中国海南省采集澳链尾蝎(Liochelesaustralasiae，又名八重山蝎)，构建蝎毒腺cDNA文库，用生物信息学工具分析La39的理化特征和结构信息，研究其抑菌活性和溶血性。

1 材料和方法

1.1 多肽和菌株

多肽：化学合成成熟肽序列FPFLLSLIPSAISALKKL，并在C端进行酰胺化修饰，合成纯度≥98%(武汉摩尔生物科技有限公司)。抗菌肽的前体肽由信号肽、成熟肽和前肽等3部分组成，前肽由一个保守的翻译后加工信号GKR起始。在蛋白质加工过程中，成熟肽C端酰胺化[15]。所以体外合成成熟肽序列也进行C端酰胺化修饰。

菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)。

1.2 cDNA文库构建

澳链尾蝎采集于中国海南省。使用电击法刺激蝎子，以使毒腺细胞进入分泌状态，电击2 d后收集毒腺组织。按照说明书步骤，使用Trizol(Invitrogen)提取Total RNA。使用Poly(A)Tract mRNA Isolation System(Promega)纯化获得Poly(A)-mRNA。按照说明书步骤，使用Superscript Plasmid System library construction kit(Gibco/BRL)构建cDNA文库。cDNA文库载体使用pSPORT1 plasmid(Gibco/BRL)，转化至E.coliDH5α细胞。

1.3 测序和生物信息学分析

使用T7启动子引物对阳性克隆子进行测序。获取序列后，使用NCBI ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和BLAST(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行初步分析；信号肽分析使用在线工具SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；同源性检索使用抗菌肽数据库APD3(http:∥aps.unmc.edu/AP/main.php)；理化性质分析使用ProtParam工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)；抗菌肽二级结构分析使用在线工具SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；抗菌肽螺旋轮分析使用在线工具Heliquest(http:∥heliquest.ipmc.cnrs.fr/)；抗菌肽表面极性分析使用在线工具3D-HM(http:∥www.ibg.kit.edu/HM/)；抗菌肽疏水性分析使用在线工具ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)；多序列比对使用ClustalX2(http:∥www.clustal.org/clustal2/)软件。

1.4 最小抑菌质量浓度分析

根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定抗菌肽La39的最小抑菌质量浓度(minimal inhibit concentration, MIC)[18]。简述如下：稀释菌液至104CFU/mL，铺96孔板，每孔加菌液160 μL，按照菌液与多肽的体积比为4∶1的比例，每孔加入2倍质量浓度梯度稀释的La39溶液40 μL，多肽终质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。氨苄青霉素、卡那霉素分别作为革兰氏阳性细菌和阴性细菌的对照；阴性对照为0.85%的NaCl溶液。每个质量浓度3组平行样，摇床温度37 ℃，转速250 r/min，培养16 h后，测定OD630值。参照阳性对照结果，确定MIC值。

1.5 体外溶血活性分析

用倍比稀释法测定抗菌肽La39的溶血活性。收集新鲜人血，离心，Hepes-NaCl缓冲液洗涤3次，重悬至7×107mL-1，铺96孔板，每孔160 μL，按照体积比4∶1的比例加入多肽溶液40 μL，多肽终质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。1% Triton X-100为阳性对照，0.85% NaCl为阴性对照，每组设置3个平行样，37 ℃孵育60 min后离心取样。测定样品的OD570值。溶血率=(样品OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100%。根据改良寇氏法计算La39的半溶血浓度HC50。

1.6 抑制菌株生长实验

采用与最小抑菌浓度分析相同的实验方法，在培养后的3～8 h，每小时测定一次OD630值，记录实验结果，绘制受试菌株在多肽处理后的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 采集澳链尾蝎，提取毒腺总RNA

澳链尾蝎，体长3～4 cm，小型蝎，几乎无毒，性情胆小，容易紧张，会翻身装死，在通风潮湿的栖息环境下生存，雌雄同体，无须交配就可以自行繁殖，见图1(a)。使用电击法刺激蝎子，以使毒腺细胞进入分泌状态，电击2 d后收集毒腺组织，提取总RNA，见图1(b)。澳链尾蝎毒腺总RNA没有明显的28S rRNA条带，只有一条显著的18S rRNA条带，一条较弱的5S rRNA条带。该实验现象与其他蝎种(如细尖狼蝎)，毒腺总RNA的电泳结果一致。

2.2 La39核苷酸序列分析

构建毒腺cDNA文库，挑选阳性克隆子，测序获得一条DNA序列(图2)。通过NCBI ORF Finder、BLAST程序比对，发现该序列编码一条抗菌肽基因，命名为La39，其cDNA全长为452 bp，由3个区域5′UTR、ORF、3′UTR组成，长度分别为66 bp、240 bp、146 bp。开放阅读框编码一条由79个氨基酸组成的前提肽。3′UTR含一个典型的poly(A)加尾信号attaaa，位于poly(A)上游24 bp处。该序列存入GenBank数据库，accession number：MT981415。

2.3 La39氨基酸序列分析

使用在线工具SignalP分析多肽序列。如图2所示，La39前体肽由3部分组成：信号肽22aa，成熟肽18aa，前肽39aa。前肽由一个保守的翻译后加工信号GKR起始，位于全序列的第41～43位。成熟肽序列为FPFLLSLIPSAISALKKL。在NCBI和抗菌肽数据库APD3中检索，发现La39可归类于无二硫键多肽家族(non-disulfide-bridged peptides，NDBPs)。比对和文献检索，发现La39与多种蝎毒素来源抗菌肽相似(图3)，与来源于澳大利亚蝎种Urodacusyaschenkoi的抗菌肽Uy234高度同源，只相差两个氨基酸[19]。

cDNA序列下方为氨基酸序列;UTR区小写，编码区大写，信号肽序列为斜体，成熟肽序列用下划线标识，前肽序列灰色标记，poly(A)加尾信号attaaa加粗。

Uy234(SRP045734); Ctriporin(G1FE62); BmKb1(Q718F4); AamAp2(G8YYA6); Imcroporin(C7B247); TsAP-1(CCQ98791); Mucroporin(B9UIY3); TsAP-2(CCQ98792)。

2.4 La39成熟肽理化性质分析

使用ProtParam工具分析，La39分子式为C97H160N20O22，分子量为1 958.46，理论等电点为10.00，无负电荷氨基酸残基，包含两个正电荷氨基酸残基，GRAVY(Grand average of hydropathicity)值为1.322。使用SOPMA工具分析，La39序列中有17个氨基酸残基参与构成α螺旋结构,见图4(a)，占比94.44%，N段F残基属于Random coil。使用Heliquest工具分析，抗菌肽La39的疏水值为0.869 H，疏水力矩为0.461 μH，螺旋轮结构如图4(b)所示，成熟肽表现出较强的两性拓扑结构。使用在线工具3D-HM和ProtScale分析抗菌肽表面极性和分子疏水性，结果同样表明La39为螺旋型多肽，表面极性高，总体为疏水性。

(a)SOPMA工具分析的二级结构；(b)Heliquest工具分析的螺旋轮结构。

2.5 La39抗菌功能鉴定

为了鉴定La39的抗菌功能，测定抗菌肽La39对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌的最小抑制质量浓度。如表1所示，La39对金黄色葡萄球菌的最小抑制质量浓度为50 μg/mL。但是，La39在200 μg/mL时，对大肠杆菌无抑制效果。

表1 La39对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑制质量浓度

2.6 La39体外溶血活性分析

溶血活性是抗菌肽在实际应用中要考虑的重要因素，研究进一步测定了La39的体外溶血活性。向新鲜人血中加入梯度浓度的La39，以测定其溶血活性。结果如图5所示，通过改良寇氏法计算半数溶血质量浓度HC50为99.6 μg/mL。

图5 La39体外溶血活性分析

2.7 La39抑制菌株生长实验

通过MICs值测定实验，发现La39对革兰氏阳性细菌有抑制作用。为进一步证实La39的抑菌效果，选择金黄色葡萄球菌作为受试对象，研究La39对该菌株生长的实时抑制作用。如图6所示，La39的质量浓度在50 μg/mL时，可以在8 h内有效地抑制金黄色葡萄球菌生长，其抑制效果与阳性对照氨苄青霉素一致。La39的质量浓度在25 μg/mL时，抑制效果减弱。

图6 La39抑制金黄色葡萄球菌生长曲线

3 讨论

在海南省澳链尾蝎毒腺cDNA文库中筛选得到一条抗菌肽基因La39。实验及分析结果显示，La39成熟肽由18个氨基酸组成，二级结构呈现为α-helix，亲水和疏水氨基酸位于分子的对立面，形成较强的两性拓扑结构。MICs测定实验、溶血实验和抑制菌株生长实验结果表明，La39对金黄色葡萄球菌的最小抑制质量浓度为50 μg/mL，对大肠杆菌无抑制活性，有溶血活性。抗菌肽La39与来源于澳大利亚蝎种Urodacusyaschenkoi的抗菌肽Uy234高度同源，这也反映了两个物种在进化上的亲缘关系[17,19]。

蝎毒素来源抗菌肽根据其序列特征及空间结构大致可分为3类。第一类抗菌肽由70多个氨基酸组成，含有3对二硫键。此类抗菌肽包括Scorpine[15]及其同源多肽，具有抗菌和抗疟疾活性。从非洲黄爪蝎毒液中分离到的Opiscorpines[20]及从老挝异蝎中分离到的Heteroscorpine-1[21]属于此类别。第二类抗菌肽通常由40多个氨基酸组成，无二硫键。除抗菌外，还具有溶细胞活性，如parabutoporin、opistoporins、hadrurin等。第三类抗菌肽一般不超过25个氨基酸，无二硫键。具有抗菌活性和溶细胞活性，如meucin1、IsCT、BmKb1、BmKb2等[22]。研究获得的抗菌肽La39，由18个氨基酸组成，没有二硫键，归于第三类别，属于短链无二硫键抗菌肽家族。

通过结构预测分析，La39和其他短链无二硫键抗菌肽家族成员一样，是一条典型的小阳离子抗菌肽。此类抗菌肽的显著特点是携带正电荷，二级结构呈现双亲性。因为本身携带正电荷，所以抗菌肽能够与细胞膜静电吸引。同时双亲性α-helix结构形成一个亲水面和疏水面，多肽的亲水性氨基酸和疏水氨基酸分别位于α螺旋两侧，有利于插入生物膜内部，从而破坏细胞膜结构。目前有4种模型用于解释抗菌肽与细胞膜的相互作用，进一步研究La39的杀菌机制能够更好地认识其抗菌功能。La39对金黄色葡萄球菌的最小抑制质量浓度为50 μg/mL，同时具有溶血活性，对La39进行分子改造，以获得杀菌效率更高，毒性更低的活性多肽，是下一步重要研究的内容。

4 结论

构建澳链尾蝎毒腺cDNA文库，筛选得到一条抗菌肽基因La39，其成熟肽由18个氨基酸组成，序列为FPFLLSLIPSAISALKKL，二级结构呈现为α-helix，是一条典型的小阳离子抗菌肽。实验分析结果表明，La39对金黄色葡萄球菌的最小抑制质量浓度为50 μg/mL，对大肠杆菌无抑制活性，有溶血活性。