贝莱斯芽孢杆菌对花生白绢病的防治效果

潘梦诗，郭文阳，张宗源，岳丹丹，亓兰达，王雪妍，张英涛

(河南省科学院生物研究所，郑州 450008)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是一年生豆科植物，是我国除油菜外的第二大油料作物，也是我国重要的出口创汇农产品[1]。近年来，花生种植面积不断增加，但连作现象明显，施肥过度，花生病害发生也随之增加，其中花生白绢病是花生病害中危害较大的一种[2]。花生白绢病病原菌为半知菌亚门无孢菌目齐整小菌核属(Sclerotiumrolfsii)，可危及花生茎基部、果柄、荚果、种仁及根，可导致花生大面积减产和品质下降，该菌产生的菌核可在土壤中存活多年，造成土传污染和防治困难[3]。目前在花生生产上主要依靠化学农药如噻呋酰胺、醚菌酯等进行花生白绢病的防治[4]，但长期使用化学农药存在病原菌抗药性、环境污染、农药残留等问题，不符合绿色农业和可持续发展的理念[5-6]。以菌治菌的生物防治则具有生态环保、高效安全、可持续的特点，成为植物病害防治的研究热点，具有广阔的应用前景[7-8]。其中，芽孢杆菌属因其产芽孢、高效的特点被广泛应用到植物病害防治中。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，近几年研究热度不断增加，国内外分离得到的贝莱斯芽孢杆菌均在生物防治方面表现出巨大的潜力[9-10]。研究发现，贝莱斯芽孢杆菌含有多种脂肽抑菌物质合成基因，其无菌发酵滤液具有广谱的抑菌性，可抑制多种植物病原菌的生长[11-13]。目前暂无贝莱斯芽孢杆菌用于花生白绢病防治方面的研究。试验以贝莱斯芽孢杆菌作为生防潜力菌，研究其对花生白绢病的生防作用，为花生白绢病的生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试作物

花生品种为豫花40号，购自河南豫研种子科技有限公司。

1.1.2 供试菌株

花生白绢病(Sclerotiumrolfsii)由河南省微生物工程重点实验室提供；贝莱斯芽孢杆菌BS-1(Bacillusvelezensis)由本实验室从土壤中分离并保存。

1.1.3 供试培养基

PDA培养基、蛋白酶培养基、淀粉酶培养基、纤维素酶培养基、嗜铁素培养基：参考文献[14]进行配制。

1.2 方法

1.2.1 平板对峙试验

将花生白绢病菌接种于PDA培养基中央，28 ℃，培养7 d，待病菌长满平板后放于4 ℃冰箱备用。挑取贝莱斯芽孢杆菌BS-1单菌落于LB液体培养基中，180 r/min，30 ℃摇床振荡培养24 h备用。将长满花生白绢病菌的平板打孔，取直径为5 mm的圆形菌块接种于PDA培养基中央，在距离菌块中央3 cm处四周各点接10 μL活化的BS-1菌液，空白对照组点接无菌水，每个处理3个重复，28 ℃，培养7 d，观察花生白绢病菌丝生长状况，计算菌丝生长抑制率，显微镜下观察菌丝结构变化。培养1个月后，对菌核计数，计算菌核抑制率。

菌丝生长抑制率=(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径×100%

菌核抑制率=(对照菌核数量-处理菌核数量)/对照菌核数量×100%

1.2.2 贝莱斯芽孢杆菌对花生白绢病菌的拮抗机制

(1)无菌发酵滤液的抑菌性。接种贝莱斯芽孢杆菌BS-1于LB液体培养基中，180 r/min，30 ℃培养24 h，将菌液于12 000 r/min，离心20 min，收集上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤。处理组将无菌滤液与PDA培养基1∶10混合制成含药平板，空白对照用LB液体培养基代替，在平板中央放置花生白绢病菌块，28 ℃，培养7 d，每个处理3个重复，观察花生白绢病菌丝生长状况，计算菌丝生长抑制率。(2)挥发性物质的抑菌性。参考文献[15]使用双板法进行测定，在PDA培养基中央放置一块直径为5 mm的花生白绢病菌块，用接种环在另一个LB平板上划线贝莱斯芽孢杆菌单菌落，将前者反扣后者之上，用封口膜将两皿接触处密封，以空白LB平板作对照，每个处理3个重复，28 ℃，培养7 d，观察花生白绢病生长状况。(3)次级代谢产物胞外酶的产生情况。将贝莱斯芽孢杆菌分别点接到已灭菌的蛋白酶培养基、淀粉酶培养基、纤维素酶培养基和嗜铁素培养基上，28 ℃，培养5 d后观察有无透明圈，每个处理3个重复。

1.2.3 盆栽防治试验

参考文献[5]方法，略作调整。将沙土与营养土1∶1混匀，250 g，分装于16.5 cm×10 cm盆栽盆中，挑选大小均一、饱满度一致的花生种子，用1% NaClO浸泡1～2 min，无菌水冲洗4～5次，播种于盆栽盆中，每盆3粒花生种子，每个处理组6个重复。待花生出芽2 d后进行花生白绢病的侵染，参考文献[16]，采用燕麦粒侵染法，于2粒燕麦粒上放置1个花生白绢病菌饼，28 ℃培养7 d，用锡箔纸包裹麦粒菌块于花生茎基部，每天喷雾保湿。处理1：菌液拌土，将107cfu/mL贝莱斯菌液50 mL与盆栽土混合均匀后播种；处理2：喷洒处理，在接种花生白绢病病菌前2 d进行107cfu/mL菌液喷洒；处理3：喷洒处理，在接种花生白绢病病菌后2 d进行107cfu/mL菌液喷洒。对照组为仅接种病菌，不做其他处理。侵染2周后取样，统计花生的病情指数，测定花生的生长指标。

花生病情指数分级，主要观察花生茎基部病斑数。0级：无病斑；1级：1～3个病斑；3级：病斑较多，面积占茎和根的1/4～1/3；5级：病斑面积占茎和根的1/2～3/4；7级：病斑成片，有烧茎现象，根部坏死。病情指数=∑(各级病株数×病情级别数)/(植株总株数×最高病情级别数)×100%。

花生生长指标包括株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重(105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒重)。

1.2.4 数据处理

采用Excel 2016 和SPSS Statistic 20.0软件进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽孢杆菌对花生白绢病的拮抗结果

贝莱斯芽孢杆菌BS-1对花生白绢病的拮抗作用如图1所示。BS-1可显著抑制花生白绢病菌丝的生长，培养7 d后，BS-1对花生白绢病菌菌丝的抑菌率为81.93%。通过显微镜观察菌丝结构可知，对照组菌丝呈线状平滑生长，BS-1处理组花生白绢病菌丝分支增多，菌丝顶端出现膨大，菌丝结构发生断裂。培养1个月后，BS-1呈云雾状生长，将白绢病菌菌块溶解，花生白绢病菌丝体消失，未见菌核的产生，对菌核生成的抑制率高达100%。结果表明，BS-1对花生白绢病菌存在明显的拮抗作用，具有良好的生防潜力。

(a)花生白绢病菌；(b)BS-1对病菌菌丝生长的影响；(c)花生白绢病菌菌丝结构(20×)；(d)BS-1对病菌菌丝结构的影响(20 ×)；(e)花生白绢病菌菌核；(f)BS-1对花生白绢病菌菌核的影响；白色箭头处可见菌丝结构膨大。

2.2 贝莱斯芽孢杆菌无菌滤液对花生白绢病的抑制作用

BS-1无菌发酵滤液可显著抑制花生白绢病的生长，菌丝抑制率达74.68%(图2)。已有研究发现，贝莱斯芽孢杆菌含有多种抗菌物质合成的关键基因，如srf AA、fen D等，因此其代谢物中可能含有抗菌活性物质，从而表现出抑菌特性[17]。

图2 无菌发酵滤液对花生白绢病的抑制作用

2.3 贝莱斯芽孢杆菌挥发性产物对花生白绢病的抑制作用

芽孢杆菌属可通过产生挥发性气体如氰化氢、2-壬醇、2-乙基己醇等，对植物病原菌产生毒杀作用[18-19]，对照组和处理组花生白绢病菌丝均生长旺盛，铺满整个平板(图3)，由此可知BS-1并非通过其挥发性产物对病原菌产生拮抗作用。

图3 贝莱斯芽孢杆菌挥发性产物对花生白绢病的影响

2.4 贝莱斯芽孢杆菌次级代谢产物胞外酶的产生情况

由图4可知贝莱斯芽孢杆菌可产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和嗜铁素。蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶均属于次级代谢产物水解酶，可降解病原菌细胞壁，破坏菌体结构，从而抑制病原菌菌丝的生长[20]。嗜铁素可将Fe3+竞争性利用，抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长[21]。由此推断，贝莱斯芽孢杆菌可通过产生水解酶等次级代谢产物抑制花生白绢病病原菌的生长。

2.5 贝莱斯芽孢杆菌处理对花生白绢病的防治效果

花生盆栽试验结果如图5和表1所示。正常花生的茎基部平滑，白色无病斑，侵染对照组花生茎根部可见明显的病斑，褐变严重，病情指数高达71.43%，说明花生白绢病病原菌对花生具有很强的致病性。与侵染对照组相比，经贝莱斯芽孢杆菌BS-1菌液处理可显著降低花生的病情指数，防效在34.00%～66.15%(P<0.05)。菌液拌土处理的防效低于喷洒处理(处理1防效34%，低于处理2和处理3)，以侵染病菌2 d后喷洒菌液的处理3生防效果最佳，对花生白绢病的防效高达66.15%。

表1 不同处理对花生白绢病的防治效果

2.6 贝莱斯芽孢杆菌处理对花生生长的影响

盆栽试验中，通过测定花生的株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重指标判断不同处理对花生生长的影响，结果如表2所示。较对照组相比结果：处理1可显著提高花生的株高和地上鲜重部分(P<0.05)，增加花生的根长、地上干重和地下干重，但无显著性差异(P>0.05)；处理2可显著增加花生的株高和地上鲜重(P<0.05)，增加花生的地下鲜重和地上干重，但无显著性差异(P>0.05)；处理3对花生地上鲜重增加显著(P<0.05)，对花生的株高、根长、地下鲜重，地上干重、地下干重均有一定的促进作用。结果表明，经贝莱斯生防菌剂处理后均可在一定程度上促进花生的生长。

表2 不同处理对花生生长的影响

3 讨论与结论

基于农业可持续发展和环保安全的理念，生物防治已成为植物病害防治的研究重点[22]。我国的微生物农药登记显示，芽孢杆菌作为登记最多的生物农药，约占50%[23]，芽孢杆菌因其可产生芽孢特性，生防效果稳定，可有效抑制病原菌的侵染[24]。贝莱斯芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，因其含有多种菌肽基因组，具有巨大的生防潜力，近几年被广大学者争先研究和报道。以贝莱斯芽孢杆菌为潜力生防菌，研究其对花生白绢病的防治效果，平板对峙试验结果发现贝莱斯芽孢杆菌可显著抑制花生白绢病的生长，具有良好的生防前景。

通过对贝莱斯芽孢杆菌生防机理的初步研究发现，贝莱斯芽孢杆菌的挥发性产物虽未对花生白绢病菌起到抑制作用，但可产生蛋白酶、纤维素酶等细胞壁水解酶，产生嗜铁素，这些次级代谢产物均可抑制病原菌的生长，这与其无菌发酵滤液具有拮抗性的试验结果相吻合。

盆栽试验结果进一步证实了贝莱斯芽孢杆菌可对花生白绢病起到良好的防治效果，对花生具有一定的促生作用。菌液喷洒处理效果优于拌土处理，其中接种病菌后2 d进行菌液喷洒的防治效果最优，花生的病情指数最低，这与其他相似研究的结果不太一致[25-26]。接种后处理优于接种前处理，一方面与生防菌特性有关，另一方面可能是由于后期接种，大量新鲜菌液直接与花生白绢病菌相接触，菌体活性最强，有效及时地抑制了花生白绢病菌的生长。这也说明，贝莱斯芽孢杆菌的生防作用不仅与其有效的代谢产物有关，还与其活菌对病原菌的相互作用有关，具体还需要进一步研究。贝莱斯芽孢杆菌可作为防治花生白绢病的潜力生防菌，后期还需进行产孢条件的优化、菌剂的制备和大田试验，进一步验证其生防效果，为其商业化生产提供支持。