不同储藏时间及温度对新鲜甘薯淀粉特性的影响

江凌峰， 周淑倩， 潘靖禹， 杨虎清， 陆国权， 李永新

(浙江农林大学农业与食品科学学院，临安 311300)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]属块茎类作物，是仅次于水稻、小麦、玉米的重要粮食作物[1]。甘薯具有较高的营养价值，富含微量元素和亚油酸等[2]。除食用以外，甘薯还可作为原料用于各类工业生产。甘薯是热带起源的作物，对储藏温度十分敏感，低温容易造成冷害的发生，因此适宜的温度对甘薯储藏具有重要的作用和研究意义。闫海峰等[3]在75 d储藏期内测定甘薯失重率、干物率、可溶性总糖、淀粉、蛋白质和维生素C的含量。杨正歌等[4]研究表明，储藏过程中，荞麦直链淀粉含量先下降再上升，淀粉膨胀度下降，且低温条件储藏时下降幅度更为明显。陶向等[5]对不同甘薯品种的块根在储藏过程中淀粉含量的变化趋势进行了研究。

淀粉是影响甘薯食用品质的重要因素之一，淀粉的理化性质决定了其在各种应用中的功能，例如，低直链淀粉含量的淀粉容易糊化并产生清晰的糊状物，而高直链淀粉含量使淀粉有较高的回生倾向[8]。对不同储藏温度甘薯品质变化以及甘薯储藏过程中淀粉含量变化已大量的研究[5-7]，但针对新鲜甘薯储藏后淀粉特性的变化却鲜有报道。本实验旨在研究不同温度储藏对甘薯淀粉含量及淀粉特性的影响，以期为甘薯储藏及加工产业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取无病虫害、无机械损伤，色泽、大小均匀、成熟度相近的新鲜“心香”甘薯用于实验研究，将挑选好的甘薯设置3个分组，分别为4 ℃、13 ℃和20 ℃组，分别在3个不同温度，75%湿度下储藏0、7、14、21、28、42、56 d。由于42、56 d这2个时间点，尤其是56 d甘薯组织大面积坏死，RNA提取失败，无法进行GWD基因表达，故此指标没有42、56 d的实验结果。

1.2 仪器与设备

MJX-280H恒温培养箱，DGG-9053AD电热恒温鼓风干烘箱，DSC-Q2000差示量热扫描仪，T6新世纪紫外可见分光光度计，Step One PlusTMReal-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block。

1.3 方法

1.3.1 甘薯淀粉制备

准确称取洗净甘薯500 g，切成块状，放入打浆机，加适量水，间断粉碎60 s，倒入100目纱袋，加0.5 L水洗提，另0.5 L水再洗提1次。将洗提液合并，过100目筛，静置18 h (每6 h将上清液弃去，再加0.5 L水洗提，直至上清液澄清)。洗提干净的淀粉置于50 ℃烘箱中干燥24 h，干燥后的淀粉研磨后过100目筛，入密封袋保存。

1.3.2 失重率测定

称取5 kg甘薯鲜薯，称质量后置于恒温培养箱内保存，于不同的储藏时间称质量。通过与原质量对比计算，得到不同储藏时间内的失重率。

1.3.3 淀粉含量的测定

参考酸水解法测定淀粉。称取鲜样1.00 g于研钵，用5 mL 85%乙醇研磨成匀浆，再用25 mL乙醇分两次清洗研钵将匀浆洗入50 mL离心管中，超声30 min。然后在5 000 r/min转速下离心10 min后弃去上清液。加入20 mL 85%乙醇，旋涡振荡均匀后再次离心，弃去上清液，取沉淀待测。在沉淀中加入6 mol/L 盐酸溶液10 mL和蒸馏水14 mL，摇匀，沸水浴60 min。取出冷却，将pH调至7.5左右后定容至100 mL容量瓶中，摇匀，DNS显色后用紫外可见分光光度计于540 nm测吸光值，计算出实测淀粉含量。根据不同储藏期甘薯的失重率可以计算出相对应0 d的鲜薯质量，再根据实测的淀粉含量计算出相对于鲜薯的淀粉含量。

淀粉质量分数= 实测淀粉质量分数×(1-失重率)

1.3.4 直链淀粉含量测定

参照 GB/T 15683—2008《大米直链淀粉含量的测定》，略加修改。称取100 mg 提取后的甘薯淀粉加入1 mL无水乙醇充分润湿样品，再加入9 mL 1 mol/L NaOH溶液，于沸水浴中分散10 min，迅速冷却后用蒸馏水定容至100 mL。吸取分散液1 mL于10 mL具塞试管中，再加入1 mL 1 mol/L乙酸溶液和0.5 mL碘液，用蒸馏水定容至10 mL后，静置5 min，于620 nm处测定吸光值。

1.3.5 溶解度与膨胀度

准确称量0.50 g 提取后的淀粉样品移入离心管中，加40 mL蒸馏水，振荡均匀后85 ℃水浴30 min，取出后冷却至室温，4 000 r/min转速下离心20 min，将上清液轻轻倒出后记录沉淀物质量，再分别将上清液和沉淀物置于培养皿中130 ℃干燥至质量恒定，溶解度(SA)和膨胀度(SP)计算公式为：

SA=(A/W)×100%

SP(g/g)=P/(W-A)

式中：P为离心管中沉淀湿质量/g；A为上清液溶出物质质量/g；W为沉淀干燥质量/g。

1.3.6 甘薯淀粉热力学测定

准确称取一定量提取后的淀粉样品并用微量进样器加入一定量的纯水混匀于铝坩埚中，使淀粉与水比值为3∶7。坩埚加盖密封后，于室温下平衡24 h，以空坩埚为参比，从20 ℃升温至100 ℃，升温速率10 ℃/min，通入氮气速率50 mL/min。计算热特征参数起始温度T0、峰值温度Tp、终止温度Tc及热焓(ΔH)。

1.3.7 甘薯淀粉酶活性测定

参考3,5-二硝基水杨酸法测定淀粉酶活性并加以修改。称取1.00 g鲜样，研磨匀浆，室温静置提取20 min，8 000 r/min转速下离心10 min，将上清液定容至100 mL，用于总淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性测定。酶活于540 nm波长下测定，以每分钟生成麦芽糖的质量为1个酶活单位[9]。

1.3.8 甘薯GWD基因家族筛选

利用GWD的保守结构域(PF01326)结合HMMER 3.0软件(http://hmmer.janelia.org/)检索甘薯基因组数据库，并通过Pfam(https://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl.de/)进行验证其结构域的存在，筛选比对得到甘薯GWD基因。从甘薯全基因组数据库(https://ipomoea-genome.org/)得到甘薯的GWD蛋白序列和CDS序列。

1.3.9 甘薯GWD进化树构建

为研究GWD基因系统进化关系，利用双子叶植物拟南芥的淀粉磷酸化酶蛋白序列作为对比参考，使用软件MEGA5.10对甘薯基因组中的GWD蛋白采用N-J法来制作淀粉磷酸化酶的系统进化树。N-J法需要选择模型，而对于蛋白质的序列来说，一般情况下应采用泊松修正(Poisson Correction)模型。

1.3.10 葡聚糖-水合二激酶GWD基因表达测定

使用RNA，天根prep Pure Plant Plus Kit试剂盒(DP441)将甘薯RNA提取出后再利用RR047A-反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。应用Step One Plus Real-Time PCR System扩增仪将目标引物基因进行实时扩增表达。

1.3.11 统计与分析

采用Origin 2017进行图表绘制。通过SPSS 20.0对数据进行方差分析(ANOVA)。用Duncan新复极差法做多重比较，差异显著水平α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 不同储藏温度下淀粉含量变化

甘薯的食味品质与淀粉含量呈正相关，淀粉含量越高，食味品质越好[10，11]。不同温度下甘薯淀粉含量都会随储藏时间延长而降解，其中4 ℃下淀粉含量下降最快。刚收获时心香甘薯有较高的淀粉含量，在前14 d的储藏期内淀粉含量下降缓慢。储藏超过21 d后，4 ℃下甘薯中淀粉含量明显低于13 ℃和20 ℃下储藏甘薯。储藏初期，13 ℃与20 ℃淀粉含量下降趋势接近，但42 d后，13 ℃淀粉含量高于20 ℃，这可能是28 d后20 ℃呼吸作用加快淀粉降解速率导致的。结果表明4 ℃低温储藏促进淀粉的降解，加速糖化，可能原因为：一是相关淀粉降解酶的活性增加，二是4 ℃下储藏改变了淀粉结构，导致淀粉颗粒变小，加快了淀粉的降解速率[7]。储藏28 d后4 ℃下甘薯已经开始出现冷害症状，42、56 d尤为严重，其酚类化合物含量增加，细胞组织坏死，细胞液外渗并且出现水渍状[12]，进一步木质化，失去食用品质，这与林婕等[13]的研究结果相符。

注：同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。图1 不同储藏时间及温度对甘薯淀粉含量的影响

2.2 不同储藏温度下直链淀粉含量变化

甘薯储藏过程中，直链淀粉含量变化如图2所示。储藏14 d内，不同温度间差异不明显。随储藏时间延长，低温储藏组(4 ℃和13 ℃)甘薯直链淀粉含量明显高于对照组(20 ℃)，直链淀粉比例升高，可能是低温下支链淀粉降解更多的原因。

图2 不同储藏时间及温度对甘薯直链淀粉含量的影响

淀粉的结构、组成及其特性是决定其应用的重要指标，甘薯淀粉的结构主要也是由直链淀粉和支链淀粉2种聚合物所构成。直链淀粉比例对淀粉的热力学特性有一定影响，其含量占比增大会导致糊化焓的下降[14]。直链淀粉与淀粉黏度特性也有一定的相关性，直链淀粉的增加会导致淀粉黏度的上升[15，16]。直链淀粉的含量还影响着淀粉分子之间的相互作用以及淀粉分子与其他食品原料(如多酚和脂类)之间的相互作用，以及在烹饪过程中淀粉分子的分解和再结合[17]，另外，直链淀粉的增加会导致淀粉回生速率加快[8]。

2.3 甘薯淀粉的溶解度及膨胀势

淀粉的溶解度和膨胀势反映了淀粉和水之间互相作用的大小，影响着甘薯淀粉及其制品的品质，淀粉的溶解主要是直链淀粉从膨胀的颗粒中逸出[18]，可以用来评价淀粉链之间的交互作用程度，包括淀粉颗粒的非结晶区和结晶区域[19]。

不同储藏温度对储藏后甘薯淀粉的溶解度如图3a所示。随着时间的延长，各个储藏温度下甘薯淀粉的溶解度逐渐下降，储藏温度对淀粉溶解度影响达到显著水平(P<0.05)，与20 ℃相比，4 ℃和13 ℃下降更快。淀粉溶解度的下降有利于淀粉的回生[14]，低温储藏能加快采后甘薯淀粉的回生过程。

不同储藏温度对储藏后甘薯淀粉的膨胀势如图3b所示。储藏温度对淀粉膨胀势影响达到显著水平(P<0.05)，储藏28 d内，4 ℃下降水平更快。出现这一现象的可能原因是储藏后不溶性直链淀粉含量上升，淀粉粒晶体更加紧密，达到糊化温度时，只是使微晶束有较大程度的松动，分子间仍有许多氢键未被拆开[20]，从而降低了水分子进入淀粉微晶束的可能性，使得甘薯淀粉膨胀度呈现下降的趋势。

图3 不同储藏时间及温度对甘薯淀粉溶解度和膨胀势的影响

2.4 不同储藏温度对淀粉热特性影响

储藏期间初始糊化温度T0随储藏时间延长而减小，4、13 ℃低温下变化更明显，说明吸水膨胀特性减弱，加快淀粉糊化过程。淀粉糊化的过程实际是淀粉结晶的溶解，其中包括直链淀粉的浸出，结晶区域支链淀粉双螺旋结构的断裂和分解[19]。

随着储藏时间的延长，淀粉糊化焓值ΔH逐渐下降，13 ℃储藏下降更为明显，28 d储藏期内4 ℃下糊化焓无明显变化。甘薯淀粉的糊化温度下降，热焓值减小，这可能与甘薯淀粉颗粒的结晶区域缩小，淀粉颗粒内部的束缚力逐渐减小有关[21]。糊化焓是淀粉糊化之前淀粉颗粒内部分子链段有序性的衡量指标，它是反映淀粉颗粒结晶度的重要参数，淀粉颗粒有序结构破坏会导致糊化焓值下降[22]，由于甘薯的支链淀粉是其结晶区域的主要构成部分，所以支链淀粉含量越少，直链淀粉含量越高，其糊化焓值越小[23]，这与本实验结果相符。

表1 不同储藏时间及温度对甘薯淀粉热力学特性的影响

2.5 不同储藏温度下甘薯淀粉酶活的变化

甘薯淀粉酶包含α-淀粉酶和β-淀粉酶，α-淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖等还原糖，同时使淀粉的黏度降低；而β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端水解麦芽糖，使甘薯煮后具有甜味[24]。两者共同作用于淀粉的降解。

由图4可知，4、13 ℃两组甘薯在56 d储藏期间β-淀粉酶活性高于α-淀粉酶活性，而20 ℃组甘薯在储藏28 d后β-淀粉酶活性逐渐接近直至高于α-淀粉酶活性。甘薯α-淀粉酶和β-淀粉酶在不同条件下淀粉降解过程中分别占据主要地位，项超等[25]的研究发现，甘薯在不同温度蒸煮下β-淀粉酶起主导作用。本结果说明低温储藏甘薯在56 d储藏期内淀粉降解过程中β-淀粉酶起主导作用。

图4 不同储藏时间及温度对甘薯α-淀粉酶、β-淀粉酶以及总淀粉酶活性的影响

不同储藏温度下总淀粉酶变化趋势如图4c所示，3组甘薯的总淀粉酶活性均呈先下降后上升的变化趋势，可能是因为初期储藏环境的改变导致总酶活性的下降，以14 d为转折点，在14 d后总淀粉酶活性开始慢慢恢复初始水平。储藏期间4 ℃总淀粉酶活性均高于另外2组，这一结果与杨明等[26]在研究不同储藏温度对马铃薯生理品质的影响中的结果相符，原因可能是低温糖化作用。数据结果显示在56 d的储藏内20 ℃下甘薯总淀粉酶活性高于13 ℃。

总淀粉酶活与淀粉含量综合分析可以得出淀粉含量与总淀粉酶活呈负相关，总淀粉酶活性高的4 ℃组淀粉含量低，这是因为淀粉降解主要是在淀粉酶的催化作用下转化成糖。也有相关实验证明低温能够促进淀粉降解相关酶基因的表达。

2.6 甘薯GWD系统进化分析

在生物学中，进化树建立是为了分析基因家族成员，得到物种起源进化或亲缘关系方面的信息，淀粉磷酸化可以改变淀粉颗粒表面有序的结构，继而促进葡萄糖苷键之间的裂解[27]。AtGWD1位于质体中，起到催化淀粉磷酸化反应，与拟南芥临时淀粉降解的起始有关[28]。通过图5可以得出，GWD家族明显分为两支，即GWD1和GWD2，甘薯中的IbGWD1-1、IbGWD1-2的蛋白序列与拟南芥中AtGWD1的亲缘关系较近。

注：At为拟南芥；Ib为甘薯。图5 GWD基因的N-J法系统进化树

2.7 葡聚糖-水合二激酶(GWD)在不同储藏时间及温度下表达情况

葡聚糖-水合二激酶(Glucan-water dikinase，GWD)是淀粉磷酸化酶，其参与的淀粉磷酸化过程是淀粉降解的第一步，也是淀粉降解前提，不仅在淀粉降解的进程中有着至关重要的作用[29]，还可以改变淀粉的理化特性，使淀粉糊透光率增大、糊化温度下降、冻融稳定性与黏度升高和凝胶强度降低等[30]。本研究检测了储藏28 d内GWD基因的表达情况。由图6a可知，与收获时相比，20 ℃储藏28 d内IbGWD1-1的表达量逐渐下降。而4、13 ℃储藏下，IbGWD1-1基因相对表达量维持在较高水平。然而，4 ℃抑制了IbGWD1-2基因表达，而13、20 ℃下，IbGWD1-2表达水平相对稳定(图6b)。

图6 不同储藏时间及温度下GWD1-1和GWD1-2的相对表达量

一般认为，GWD负责将淀粉磷酸化，促进淀粉降解。淀粉测定结果显示低温促进淀粉降解，这可能跟低温下IbGWD1-1被激活有关。从表达结果显示，IbGWD1-1被低温强烈诱导，因此IbGWD1-1可能与低温诱导淀粉加速降解相关。

3 结论

不同储藏温度对甘薯淀粉特性有显著影响。随着储藏时间的延长，淀粉含量逐渐下降，这与总淀粉酶活性和淀粉磷酸化酶IbGWD1-1表达量相关，且低温储藏(4、13 ℃)下在此过程中β-淀粉酶起主导作用。13 ℃储藏下甘薯淀粉溶解度逐渐下降，直链淀粉含量缓慢上升，淀粉更易回生；糊化起始温度以及热焓值逐渐下降，淀粉稳定性提高，可能原因是在13 ℃储藏下甘薯淀粉颗粒的晶体结构的无序化程度逐渐增加，结晶区内的结合力减弱，导致淀粉糊化不再需要较高的温度，从而造成糊化温度降低，且热焓值降低更为明显。4 ℃淀粉降解快的另一个可能原因是4 ℃储藏改变了淀粉结构，导致淀粉颗粒变小，加快了淀粉的降解速率。