微波-超声波协同辅助提取紫苏精油工艺优化及抑菌活性的研究

郑哲浩， 禹 宸， 邱林燕， 江苏萱， 吴晓蓉， 毛晓锐， 包陈洁， 韩晓祥， 修丽丽

(浙江工商大学应用化学系，杭州 310018)

紫苏(PerillafrutescensL. Britton)是唇形科(Labiatae)紫苏属一年生短日草本植物，又名赤苏、红苏、香苏等，是国家卫生部首批颁布的药食两用中药之一[1]。紫苏种植地区广泛，美国、日本等多个国家对紫苏已经达到了商业化规模的栽培与利用。紫苏叶精油是紫苏叶经提取后的挥发性油状液体，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌、抗抑郁、降血压等多种活性[2-4]，在食品、医药和化妆品等领域具有广泛的应用。气候、环境、品种、产地和提取方法的不同，紫苏精油的化学组成成分和含量也大有不同，从而影响了紫苏精油的生物活性和应用[5]。

传统的精油提取法主要是水蒸汽蒸馏法，此方法虽然绿色安全且操作简单，但存在提取时间长、效率低、耗能高等缺点[6]。随后开发的许多提取技术，如超声波辅助提取法[7]、微波辅助提取法[8，9]、酶辅助提取法[10,11]、超临界CO2提取法[12,13]等广泛应用到功能因子提取研究中，其中微波和超声波辅助提取法因操作简便、经济高效、绿色无污染、对设备和操作的要求低而受到关注。近年来，微波-超声波协同辅助提取技术得到快速发展，该技术是将微波和超声波结合，利用了微波的穿透效应和超声波的空化作用共同作用于提取物，提高提取效率，特别应用于不稳定天然产物提取[14-16]。郭玲玲等[14]在固定超声功率的条件下，优化微波-超声波协同辅助提取紫苏黄酮工艺，在较短提取时间和较低提取温度下，得到较好的紫苏黄酮提取率。王颖等[15]优化了超声-微波协同技术提取白胡椒精油，研究发现利用超声-微波协同技术提取精油效率显著优于常规提取方法。应瑞峰等[16]对比研究了传统热水提取法与超声波微波复合辅助提取法对桑黄多糖提取率的影响，结果表明，协同提取法有效提高了提取率，多糖得率最高达到10.6%。本实验采用微波-超声波协同方式辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油，优化提取工艺，并对精油的组成成分以及抑菌活性进行研究，研究成果为紫苏精油的开发利用提供科学依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

干紫苏叶：选自广西南宁的新鲜紫苏叶，洗净烘干，粉碎为40目，备用。NaCl、Na2SO4、石油醚、无水乙醇等(均为AR)。LB肉汤、营养琼脂(均为BR)。

800Y多功能粉碎机，XH-300A微波-超声波组合萃取仪，7890A-5975C安捷伦气质联用仪。

1.2 紫苏精油提取

1.2.1 微波辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油

称取40目筛紫苏叶粉末40 g置于圆底烧瓶中，加入适量的3%NaCl溶液，将其置于微波-超声波组合萃取仪中，改变微波操作条件优化紫苏精油提取工艺，同时利用蒸馏萃取法提取精油6 h。在单因素实验基础上，利用Box-Benhnken设计的响应面分析法优化微波提取工艺。提取结束后用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，旋蒸，得紫苏精油，进而计算紫苏精油提取率。

紫苏精油提取率=(紫苏精油质量/紫苏叶粉末质量)×100%

1.2.2 微波-超声波辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油

在微波优化条件，即料液比1∶6，微波功率933 W条件下，在微波-超声波组合萃取仪中改变超声条件优化紫苏精油提取工艺。单因素实验基础上，利用响应面分析法优化微波-超声波辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油。

1.3 紫苏精油GC-MS分析

在7890A-5975C气质联用仪(DB-WAX色谱柱，60 m×0.25 mm×0.5 μm)上对紫苏精油组成进行分析，获得GC-MS分析总离子流图。通过人工图谱解析及NISTl4谱库检索定性，并利用面积归一法定量分析各成分的相对质量分数。GC-MS分析条件：进样口温度240 ℃，进样量0.2 μL，分流比为100∶1，恒流模式，柱流速1 mL/min；初始柱温30 ℃，保持10 min，以2 ℃/min升到240 ℃，保持10 min。质谱条件为离子源EI，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质量数扫描范围33～500 amu。

1.4 紫苏精油抑菌活性测定

菌株处理：将供试菌划线平板培养进行活化。然后挑取单菌落接种到适量的LB肉汤中摇床二次活化，用生理盐水配制菌悬液，菌落数约为1×106CFU/mL，摇匀。

精油样品处理：紫苏精油和无水乙醇体积比1∶1混合成精油样品，无水乙醇作为助溶剂使精油更易与液体培养基混合，达到最佳抑菌效果。

MBC(最小杀菌浓度)测定：采用二倍稀释法，即肉汤稀释法测定紫苏精油最小杀菌浓度。取灭菌试管按每组7支进行分组，向每组第1支试管中加入精油样品和肉汤，试管混合物体积8 mL，精油体积比20 μL/mL，混匀后依次取4 mL移入下一管进行梯度稀释至第5号试管。1～5号试管精油体积比分别为20、10、5、2.5、1.25 μL/mL，分别向各试管加入菌悬液。第6号试管加液体培养基和菌液，作为对照；第7号试管加液体培养基、菌液和无水乙醇，作为乙醇对照。摇床恒温培养24 h，生理盐水稀释，取100 μL涂布平板培养24 h，将培养皿中无明显菌落生长最小样品体积比定义为样品对供试菌的MBC。

1.5 统计分析方法

响应面分析采用软件Design-Expert 6.0.5，其他分析采用Excel、Origin 2018和SPSS 26.0软件进行数据分析及显著性分析，所有实验重复3次，取均值。

2 结果与讨论

2.1 紫苏精油提取工艺确定

2.1.1 微波辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油单因素实验

由图1可见，当料液比从1∶4增加到1∶6时，紫苏精油提取率显著增加；当料液比为1∶6时，紫苏精油提取率达最大值为1.91%；进一步增加料液比，即增加溶剂使用量，紫苏精油提取率降低，这是因为溶剂量的增加，精油与溶剂接触面积增大，传质速度提高，提取率增加；而溶剂量过大，精油会在溶剂中部分溶解，导致提取率较低[17]。从提取效率，提取成本等方面综合考虑，将1∶6作为最佳提取料液比。

图1 微波辅助不同提取条件对紫苏精油提取率的影响

由图1可见，紫苏精油提取率随提取时间的延长而呈现先上升后下降趋势。当提取时间为6 min时，紫苏精油提取率最大。进一步延长提取时间，紫苏精油提取率下降。微波快速、均匀的加热功能，可在短时间内对细胞膜进行破碎从而加速溶剂对精油的溶解和渗透，使紫苏精油快速释放，提高精油含量。而过长的提取时间，不仅增加杂质的溶出量，使产品分离困难，同时也造成设备损耗，增加维护成本。因此，确定提取时间为6 min。

由图1可知，随微波功率的增加，紫苏精油提取率增加，当微波功率为900 W时，紫苏精油提取率最高，为2.1 %。继续增加提取功率，紫苏精油提取率下降。适当的微波功率下，微波作用引起的极性振荡使细胞膜结构破裂，从而促进紫苏精油浸出到溶剂中，但微波功率过高，易产生局部过热现象，导致紫苏精油挥发及分解。从提取效率、节能和安全角度考虑，选用微波900 W进行紫苏精油提取。

由图1可见，紫苏精油提取率随提取温度的增加呈先上升后下降的趋势。当提取温度为60 ℃时，紫苏精油提取率达最大值为2.1 %；继续增加提取温度，紫苏精油提取率下降。提取温度的升高增加了溶剂分子的活性，提高了扩散系数，同时也增加紫苏精油的溶解度，提高传质效率。但温度过高会使紫苏精油不稳定，易挥发分解，从而降低紫苏精油提取率。因此选择60 ℃进行提取工艺研究。

2.1.2 响应面法优化微波辅助提取紫苏精油工艺

结合单因素实验结果，根据Box-Behnken响应曲面设计的中心组合实验设计原理，以紫苏精油提取率为指标，选取微波温度、微波功率、微波时间这3个因素，采用三因素三水平响应曲面分析方法对提取条件进行优化。在响应面实验设计中，选用料液比为1∶6。实验因素与水平设计见表1。

表1 微波辅助提取响应面分析实验设计表

响应曲面法实验设计及结果见表2。运用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归拟合，所得响应面二次回归方程方差分析见表3。由此可得二次回归方程为：

Y=2.09+0.1A+0.074B+0.041C-0.22A2-0.14B2-0.1C2+0.035AB+0.015AC+0.032BC

表2 微波辅助提取条件优化实验设计与结果

表3 微波辅助提取响应面二次回归方程方差分析

由方差分析表3可知，模型F值为78.49，远大于分布表中的F值，且模型P值极显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P>0.05)，说明模型与实际实验的拟合效果相近，能够较好的反映精油提取率与因素之间的关系。相关系数R2为0.990 2，模型校正系数R2为0.977 6，两者大致相同，说明该模型在可允许接受范围内。除微波温度与微波时间的交互项不显著外，其他作用均显著。同时由表中数据可见，影响精油提取率的优先条件是微波温度(A)>微波功率(B)>微波时间(C)。

结合二次回归模型数学分析结果，微波提取紫苏叶精油的最佳工艺参数为：微波温度62.65 ℃，微波功率932.84 W，微波时间6.28 min，在此条件下苏叶精油提取率的预测值为2.169%。鉴于实验操作的可行性，将上述工艺参数修正为：微波温度63 ℃，微波功率933 W，微波时间6.5 min，该条件下进行3组平行实验，所得紫苏精油平均提取率为2.11%，实验数据与预测数据基本一致，说明该模型具可靠性。

2.1.3 微波-超声波辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油单因素实验

在该微波优化条件，即料液比1∶6，微波功率933 W条件下，考察超声时间、超声温度及超声功率对紫苏精油提取率的影响，结果见图2。紫苏精油提取率随超声时间的增加而增加，在4 min时达到最大值为2.29%。随着超声时间的延长，紫苏精油提取率下降。微波、超声波共同作用的结果使得较少时间下即可获得较大量紫苏精油提取率。紫苏精油提取率随提取温度的增加同样呈现先上升后下降的趋势。提取温度的升高，溶剂分子活性增加，提取率增加，但温度过高会使紫苏精油不稳定，易挥发分解，导致精油提取率下降。紫苏精油提取率随着超声波功率的增加而呈现先增加后下降的趋势，在微波-超声波功率933～250 W的条件下，紫苏精油提取率为2.3%，相较于单个微波作用，紫苏精油提取率进一步增加。而过高的超声波功率也会导致紫苏精油的破坏，因此选择超声波功率250 W进行提取研究。

图2 微波-超声波辅助不同提取条件对紫苏精油提取率的影响

2.1.4 响应面法优化微波-超声波辅助提取紫苏精油工艺

在单因素实验结果基础上，利用响应面法优化微波-超声波辅助提取紫苏精油工艺。选取超声波功率、微波-超声温度、微波-超声时间这3个因素，采用三因素三水平进行设计，实验因素与水平设计见表4。料液比为1∶6，微波功率933 W。

表4 微波-超声波辅助提取响应面分析实验设计表

响应曲面法的实验设计及结果见表5。运用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归拟合，所得二次回归方程方差分析见表6。由此可得二次回归方程为：

Y=2.30-0.058D+0.056E+0.1H-0.35D2-0.2E2-0.1H2+0.03DE-0.035DH-0.028EH

表5 微波-超声波辅助提取条件优化实验设计与结果

表6 微波-超声波辅助提取的响应面二次回归方程方差分析

由表6方程分析表可得，该模型P值极显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P>0.05)，同时F值(228.93)远大于分布表中的F值(6.71)，说明回归方程模型可用于紫苏精油提取的优化。相关系数R2为0.996 6，模型校正系数R2为0.992 3，说明模型的拟合度和可信度较高。H、D2、E2和H2对精油提取率有极显著影响；D、E、DE、DH以及EH对精油提取率有显著影响。

结合二次回归模型数学分析结果，微波-超声波提取紫苏精油的最佳工艺参数为：超声功率244.84 W，微波-超声温度50.49 ℃，微波-超声时间4.49 min，在此条件下紫苏精油提取率预测值为2.381%。鉴于实验操作的可行性，将工艺参数修正为：超声功率245 W，微波-超声温度50 ℃，微波-超声时间4.5 min，3组平行实验结果所得紫苏精油平均提取率为2.34%，实验数据与预测数据基本一致，说明该模型具可靠性。优化后的提取率2.34%远大于传统提取率0.2%～1.0%[18,19]，说明本研究对紫苏精油的提取具有一定的指导意义。

2.2 GC-MS分析

采用GC-MS对提取的紫苏精油进行成分分析，结果如表7。GC-MS一共鉴定出46种化合物，其中质量分数较高的组分为紫苏醛(33.88%)，β-石竹烯(16.96%)，反式-α-柠檬烯(9.93%)，洋芹脑(6.26%)，2-丁酰呋喃(4.86%)，D-柠檬烯(3.70%)，trans-Shisool(3.17%)。精油中紫苏醛的含量较高，可以认定该精油为紫苏醛型精油，紫苏醛和柠檬烯约占了精油成分的50%，它们是紫苏香味的主要来源，也是紫苏精油的主要活性成分。

表7 紫苏精油的GC-MS鉴定结果

2.3 紫苏精油的抑菌活性

图3是紫苏精油抑菌活性图。紫苏精油对3种菌都具有较好的抑制作用，从抑菌趋势可以看出紫苏精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用要高于大肠杆菌和希瓦氏菌。精油的抑菌方式一般有2种，一是破坏细胞膜结构，使得细菌细胞内物质泄漏，刺激细胞自溶，导致细菌死亡；二是精油小分子进入细菌细胞，影响细菌的生理活动，使其死亡。紫苏精油对革兰氏阳性菌的抑菌活性比革兰氏阴性菌更好，这可能是因为革兰氏阴性菌的外膜有脂多糖，可以提供亲水性表面，同时能够阻止大分子和疏水性物质进入细胞[20]，从而对紫苏精油具有相对抗性，结论与许泽文等[21]关于柠檬草精油抑菌的研究结果相一致。艾薇等[22]关于山姜精油的抑菌也得到了相似结论，发现山姜精油对大肠杆菌的MBC为12.5 mg/mL，对金黄色葡萄杆菌的MBC为6.25 mg/mL。从GC-MS分析可知紫苏精油中主要成分为紫苏醛和柠檬烯，两者具有协同抑制细菌生长的作用，因此精油具有较好的抑菌效果[23]。当紫苏精油体积比为10 μL/mL的时候，3种菌的细菌总数(TVC)都为零，说明这3种菌已经被完全杀死，因此可认为紫苏精油对这3种菌的MBC为10 μL/mL。

注：小写字母不同表示显著差异(P<0.05)。图3 紫苏精油的抑菌作用

3 结论

本研究利用微波-超声波协同辅助同时蒸馏萃取法提取紫苏精油，所获最佳提取工艺为：料液比1∶6，微波功率933 W，超声功率245 W，微波-超声温度50 ℃，微波-超声时间4.5 min。该条件下，紫苏精油提取率为2.34%。紫苏精油GC-MS分析表明，其主要含有紫苏醛(33.88%)、β-石竹烯(16.96%)、反式-α-柠檬烯(9.93%)、洋芹脑(6.26%)、2-丁酰呋喃(4.86%)、D-柠檬烯(3.70%)，trans-Shisool(3.17%)等。抑菌实验表明紫苏精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和腐败希瓦氏菌都具有较好的抑菌效果，MBC都为10 μL/mL。