微核糖核酸-124靶向Jagged2对低氧性肺动脉高压新生大鼠血管重塑的影响

房巧燕 袁 昊 陶 凤

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是一种以肺动脉压和肺血管阻力进行性增加为特征的疾病。在极少数情况下，PH可导致婴儿发生右心衰竭并死亡[1]。缺氧被认为是PH发病的危险因素之一[2]。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)是血管系统的重要组成部分，在低氧反应中起着关键作用，其功能失调与PH的发生、发展密切相关[3-4]。近年的研究[5]结果表明，慢性缺氧诱导的PASMC凋亡抑制和增殖增强是低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)发生的主要原因。罹患HPH新生儿的病死率较高，故亟须寻找治疗该疾病的潜在靶点。微核糖核酸(microRNA, miRNA)是一种非编码小RNA，通过与靶基因3’-非翻译区(3’-UTR)结合负向调节基因的表达[6]。已有研究[7]结果表明，多种miRNA参与HPH的发生、发展，其中miRNA-124(简称miR-124)在缺氧处理的PASMC中表达下调，并具有抗增殖和促分化作用[8]，提示干预miR-124可能具有治疗HPH的作用。本研究拟构建HPH新生大鼠模型，探讨miR-124过表达对HPH新生大鼠血管重塑的影响，并探究miR-124与Jagged2的靶向关系及其对split多毛增强子1(hairy and enhancer of split 1，Hes-1)蛋白表达的影响，以期为HPH的临床诊疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只体重为15～25 g的7日龄Wistar雄性新生大鼠购自广州中医药大学，许可证号为SYXK(粤)2019-0144。所有动物均饲养于温度为25 ℃、湿度为55%的环境中，12 h明暗周期循环，提供充足的食物和水进行适应性饲养。按照3R[减少(reduction)、替代(replacement)、优化(refinement)]原则进行实验，符合国家实验室动物伦理保护标准及相关法规。

1.2 主要实验试剂 NO测定试剂盒(货号：A013-2-1)、内皮素(endothelin，ET)测试盒(货号：H093)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)测试盒(货号：H185)均购自南京建成生物工程研究所。miR-124激动剂(agomir)与miR-124 阴性对照(NC)由广州市锐博生物科技有限公司合成。H-E染色试剂盒(货号：C0105)购自上海碧云天生物科技有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：D0010)购自北京索莱宝生物科技有限公司。Jagged2一抗(货号：2205)和Hes-1一抗(货号：11988)均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要实验仪器 MP160型16通道生理仪购自美国BIOPAC公司，光学显微镜购自日本Nikon公司，酶标仪Fax-20100购自美国INStat公司，蛋白凝胶成像仪和电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及模型制备 将48只Wistar新生大鼠随机分为常氧组、低氧组(低氧刺激)、miR-124组(低氧刺激+miR-124 agomir)和miR-124 NC组(低氧刺激+miR-124 NC)，每组12只。miR-124组和miR-124 NC组分别于大鼠尾静脉注射200 μg/kg的miR-124 agomir和miR-124 NC ，每日1次，连续6 d；末次注射24 h后，除常氧组大鼠予正常饲养外，其余3组大鼠均置于氧气(O2)体积分数为0.1的常压低氧舱中，每天8 h，连续放置28 d。采用右心导管法检测各组大鼠的右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)：首先切开大鼠颈部皮肤，分离右颈外静脉，将含肝素钠的导管缓慢插入静脉中，行至右心室时将导管末端连接探测仪，观察波形并调整导管位置，待波形典型且稳定后记录，应用PowerLab软件分析数据[9]。若低氧组大鼠RVSP较常氧组明显增高，则证实HPH大鼠模型建立成功[10]。

1.4.2 样本采集 缺氧暴露28 d后，腹腔内注射10%乌拉坦(10 mg/kg)麻醉各组大鼠，使用压力信号采集系统记录平均肺动脉压(mPAP)。打开大鼠胸腔，分离右心室，计算右心室肥大指数[右心室与左心室加室间隔的湿重比：RV/(LV+S)]。迅速取出肺组织，左肺置于4%多聚甲醛中固定，右肺液氮速冻后置于-80 ℃中保存。收集腹主动脉血液样本，离心，取上清液，置于-20 ℃中保存。

1.4.3 肺组织病理学检测 将固定在4%多聚甲醛中的肺组织，经脱水透明和浸蜡包埋处理，制备成厚度为4 μm的石蜡切片，行H-E染色。于光学显微镜下观察并拍摄大鼠肺小动脉的病理学变化。应用Image-pro Plus 6.0软件测量肺动脉的外径(external diameter，ED)、内壁厚度(medial-wall thickness，MT)、内侧横截面积(medial cross-sectional area，MA)、管腔横截面积(vessel lumen cross-sectional area，VA)和总动脉横截面积(total arterial cross-sectional area，TAA)。计算肺血管MT与ED的比值(即MT%)、MA与TAA的比值(即MA%)，以评估肺动脉血管重塑的程度。

1.4.4 血管活性物质检测 根据测定试剂盒说明书的步骤，测定血清NO、ET和Ang Ⅱ水平。

1.4.5 双荧光素酶实验验证miR-124与Jagged2的靶向关系 应用TargetScan软件分析，预测miR-124与Jagged2 3’-UTR的结合位点。于无菌条件下分离出大鼠肺动脉，切除结缔组织，制备成原代PASMC悬液，连续传代、培养至对数生长期，接种于96孔培养板上，将细胞分为miR-124 模拟物(mimics)+Jagged2 野生型(WT)组、miR-124 NC+Jagged2 WT组、miR-124 mimics+Jagged2突变型(MUT)组和miR-124 NC +Jagged2 MUT组，每组含3个重复样本，采用pmirGLO荧光素酶报告质粒行共转染处理。转染48 h后，应用双荧光素酶检测试剂盒检测各组PASMC荧光强度。

1.4.6 实时荧光定量PCR实验 使用RNA提取试剂盒从大鼠肺组织匀浆中提取总RNA。应用NanoDrop分光光度计测定RNA的水平和纯度，PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录成cDNA。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共45个循环；72 ℃延伸1 min。采用2-ΔΔCT法对组织中miR-124及Jagged2 mRNA的表达量行相对定量分析。引物序列见表1，miR-124和Jagged2 mRNA分别以U6和β-actin作为内参。

表1 引物序列

1.4.7 免疫印迹实验 从肺组织匀浆中提取总蛋白质。蛋白质水平应用Pierce BCA蛋白测定试剂盒进行定量。应用7.5%～12.0%含十二烷基硫酸钠的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质样品，后将蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下，以5%脱脂牛奶封闭含目的蛋白质的PVDF膜1 h后，在4 ℃下，将PVDF膜与Jagged2、Hes-1、β-actin一抗(稀释倍数为1∶1 000)分别共同孵育过夜。以TBST溶液洗涤PVDF膜4次后，在室温下，将PVDF膜与二抗共同孵育1 h，清洗并曝光显色。以β-actin为内参蛋白质，分析目的蛋白质的相对表达量。

2 结 果

2.1 miR-124对HPH大鼠右心循环和肺动脉血管重塑的影响 与常氧组相比，低氧组和miR-124 NC组大鼠的mPAP、右心室肥大指数、MT%和MA%均显著升高(P值均<0.05)。与低氧组和miR-124 NC组相比，miR-124组大鼠的mPAP、右心室肥大指数、MT%和MA%显著降低(P值均<0.05)。低氧组与miR-124 NC组间上述指标的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

A 常氧组 B 低氧组 C miR-124组 D miR-124 NC组图1 4组HPH大鼠肺动脉病理学变化(H-E染色，×400)

表2 miR-124对HPH大鼠右心循环和肺动脉血管重塑的影响

2.2 miR-124对HPH大鼠肺动脉病理学变化的影响 肺组织H-E染色结果显示，常氧组大鼠肺动脉壁完整光滑，细胞分布整齐、致密，管壁薄而均匀，肌层未见增厚；与之相比，低氧组和miR-124 NC组大鼠肺动脉壁明显增厚，管腔变窄，细胞排列紊乱，呈现肺动脉重塑特征。与miR-124 NC组相比，miR-124组大鼠的肺动脉壁增厚程度明显减轻，管腔狭窄不明显。见图1。

2.3 miR-124对HPH大鼠血清NO、ET和Ang Ⅱ水平的影响 与常氧组相比，低氧组和miR-124 NC组大鼠血清ET和Ang Ⅱ水平均显著升高(P值均<0.05)，NO水平显著降低(P<0.05)。与低氧组和miR-124 NC组相比，miR-124组大鼠血清ET和Ang Ⅱ水平显著均显著降低(P值均<0.05)，NO水平显著升高(P<0.05)。低氧组与miR-124 NC组间上述NO、ET和Ang Ⅱ水平的差异无统计学意义(P值均>0.05)。见表3。

表3 miR-124对HPH大鼠血清中NO、ET和Ang Ⅱ水平的影响

2.4 miR-124对大鼠肺组织HPH相关mRNA和蛋白质表达的影响 与常氧组相比，低氧组和miR-124 NC组大鼠肺组织的miR-124水平均显著降低(P值均<0.05)，Jagged2 mRNA和Jagged2、Hes-1蛋白质水平均显著升高(P值均<0.05)。与低氧组和miR-124 NC组相比，miR-124组大鼠的miR-124水平显著升高(P值均<0.05)，Jagged2 mRNA和Jagged2、Hes-1蛋白质水平均显著降低(P值均<0.05)。低氧组与miR-124 NC组间上述数值的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表4和图2。

1 常氧组 2 低氧组 3 miR-124组 4 miR-124NC组图2 各组大鼠肺组织的Jagged2、Hes-1蛋白质表达情况

表4 miR-124对HPH大鼠肺组织miR-124及靶基因的影响

2.5 miRNA-124与Jagged2靶向关系的预测与验证 预测结果显示，Jagged2 3’-UTR序列上存在miR-124的连续结合位点，见图3。与miR-124 NC+Jagged2 WT组(1.14±0.12)相比，miR-124 mimics+Jagged2 WT组(0.58±0.06)荧光素酶活性显著降低(t=26.040，P<0.05)，miR-124 mimics+Jagged2 MUT组(1.05±0.07)与miR-24 NC+Jagged2 MUT组(1.09±0.11)荧光素酶活性的差异无统计学意义(P值均>0.05)。

图3 miR-124与Jagged2 3’ UTR的结合位点示意

3 讨 论

新生儿PH是临床常见的急危重症，病死率为40%～50%。在婴幼儿中，有多种PH表型：继发于先天性心脏病伴有左右分流的PH、由于新生儿抵抗力下降而导致的持续性PH、急性或慢性肺部疾病引起的低氧血症及特发性肺动脉高压等[11-12]。肺血管重塑是HPH的显著特征，可使肺动脉压和肺血管阻力进行性增加，最终导致患者发生右心衰竭或死亡[13]。缺氧刺激PASMC的增殖和迁移，导致肺血管壁增厚和肌化，为肺血管重塑的病理生理学特征，也是HPH的重要发生机制之一[14]。本研究通过将新生大鼠暴露于O2体积分数为0.1的条件下28 d，建立HPH新生大鼠模型，结果发现，低氧刺激引起大鼠mPAP、MT%和MA%显著升高，右心室肥大，显微镜下可见肺动脉壁明显增厚，管腔变窄，细胞排列紊乱，呈现肺动脉重塑特征；这些均与人体PH的变化和病理学特征相似，表明大鼠HPH模型构建成功。一些细胞因子被认为与HPH发病密切相关，内源性血管扩张剂(如NO)的减少和血管收缩因子(如ET和Ang Ⅱ)的增多在肺血管阻力增加和重塑中起重要作用[15-16]。缺氧刺激可破坏NO与Ang Ⅱ和ET之间的平衡，从而触发以平滑肌细胞增殖为特征的PH和血管重塑。在本研究中，低氧时血清NO水平显著降低，而Ang Ⅱ和ET水平显著升高，这与以往的研究结论一致[17]。

miRNA已被认为是影响多种心血管疾病发生、发展的一类转录后调节因子。Caruso等[18]研究发现，PH患者机体分离出的肺动脉存在miR-124明显下调的征象，这与内皮细胞代谢和增殖异常有关。在本研究中，新生大鼠肺组织的miR-124在低氧诱导下表达水平显著下调，该结果与Li等[19]的研究结论一致。Zhang等[20]研究发现，在分离自PH患者的肺外膜纤维细胞中过表达miR-124，可抑制细胞增殖，改善PH疾病表型。本研究发现，miR-124组大鼠肺动脉壁增厚程度明显减轻，管腔狭窄不明显，mPAP、MT%、MA%、右心室肥大指数、ET和Ang Ⅱ水平均显著降低，NO水平显著升高，表明miR-124可能在HPH的发生过程中起重要的保护作用。此外，根据TargetScan软件预测发现，Jagged2为miR-124的靶基因，miR-124与Jagged2 mRNA 3’-UTR存在连续结合位点，且被双荧光素酶实验结果证实。Jagged2是Notch信号通路的配体之一，调控细胞的生存和分化[21]。Jagged2介导的Notch信号在神经祖细胞和造血祖细胞的增殖中起到关键调节作用。应用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制Jagged2可抑制Notch信号转导，降低Hes-1的表达量，减轻细胞增殖[22]。在本研究中，HPH大鼠肺组织的Jagged2、Hes-1蛋白质水平显著升高，表明HPH大鼠Jagged2、Hes-1蛋白质表达上调可能与肺血管重塑有关。过表达miR-124则可抑制缺氧诱导的Jagged2、Hes-1蛋白质水平的升高，表明miR-124过表达可能通过抑制Jagged2的表达介导对HPH的改善作用。

综上所述，miR-124在HPH的发病机制中起着关键作用，过表达miR-124可能通过靶向下调Jagged2，抑制内皮细胞的异常增殖，缓解HPH诱导的肺血管重塑。该发现或为miR-124作为治疗HPH的新靶点提供一定参考；然而，miR-124对HPH新生大鼠的作用机制较为复杂，相关结论仍需进一步研究确证。