肺癌根治术中非通气侧肺持续中-低流量给氧对老年患者肺泡巨噬细胞的影响

钟 巍 周俊辉 高 洁 房 芳 刘晓乐 张娜娜 孟宪慧

胸腔镜肺癌根治术中常用的单肺通气(OLV)是一种非生理性呼吸模式，可导致低氧血症、肺损伤甚至急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，增加术后肺部并发症(PPC)的发生，影响患者临床预后。非通气侧肺萎陷和复张引起的缺血-再灌注损伤，以及OLV期间机械通气引起的氧化应激反应，可造成明显的肺损伤[1]。肺泡巨噬细胞(AM)是ARDS及肺损伤的重要效应细胞，在肺部炎症反应及组织修复中具有重要作用[2]。有研究[3]结果表明，OLV后对非通气侧肺进行持续给氧可改善食管切除术OLV结束后肺的氧合功能，减轻全身和非通气侧肺的炎症和氧化应激反应。然而，OLV时非通气侧肺持续中-低流量给氧减轻胸腔镜下肺癌根治术患者非通气侧肺损伤的机制尚有待进一步研究。本研究拟探讨非通气侧肺持续中-低流量给氧是否可通过调节AM分化及其功能减轻胸腔镜下肺癌根治术老年患者非通气侧肺损伤。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2018年12月20日—2019年9月5日在河南省胸科医院择期行胸腔镜下肺癌根治术的老年患者60例，其中男33例，女27例，年龄65～80岁，体重45～85 kg，身高145～185 cm。符合ASA分级Ⅱ或Ⅲ级。排除标准：严重的肺部疾病；左心室射血分数<40%；肾功能不全；痴呆、帕金森病、脑卒中、吸毒或长期服用精神类药物；严重的心脏传导阻滞、高血压、冠心病和糖尿病；术前语言交流及认知功能障碍；长期服用类固醇药物、激素类药物；近期有重大手术史。剔除标准：围手术期发生不良事件，如出血量>600 mL；围手术期感染；麻醉时间>5 h；再次手术。采用随机数字表法将纳入患者分成研究组和对照组，每组30例。本研究方案经医院医学伦理委员会审核、批准(审批号：2018-03-012)，术前已征得患者及其委托人的同意与授权，并签署知情同意书。

1.2 麻醉方法 所有患者术前常规禁饮、禁食，入手术室后常规监测心电图、血压及经皮动脉血氧饱和度(SpO2)。开放上肢外周静脉通道，输注乳酸钠林格液6～8 mL/kg。局部麻醉(简称局麻)下行桡动脉穿刺置管并监测动脉压。全身麻醉(简称全麻)诱导采用丙泊酚1.5～2.0 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和罗库溴铵0.6 mg/kg静脉注射，选择大小合适的可视化双腔支气管导管进行气管内插管。插管后分别于仰卧位及侧卧位，通过可视化镜头检查气管导管的位置正确与否。麻醉诱导完成后行右侧颈内静脉穿刺置管。麻醉维持采用全凭静脉麻醉，静脉泵注丙泊酚4～8 mg/(kg·h)、瑞芬太尼0.05～0.2 μg/(kg·h)、右美托咪定0.2～0.7 μg/(kg·h)及罗库溴铵0.3～0.6 mg/(kg·h)进行麻醉维持。术中通过调控麻醉深度使脑电双频指数(BIS)维持于40～60。双肺通气时，以潮气量6～8 mL/kg进行通气，OLV时，以潮气量4～5 mL/kg进行保护性OLV。术中呼气末正压由麻醉医师判断选择。OLV时以空-氧混合通气调节FiO2，以维持SpO2≥92%。人工记录术中呼吸频率、呼气末正压和FiO2。按照常规，若患者术中发生低氧血症(SpO2<90%)，则进行肺复张。术中平衡晶体液滴速为3 mL/(kg·h)。术毕前15 min静脉注射羟考酮0.1 mg/kg，缝皮前给予0.25%罗哌卡因切口皮下注射。手术结束时，应用4个成串刺激(TOF)评估神经肌肉组织中是否残留肌肉松弛药，若TOF监测值≥0.9，予可拔除气管导管；若TOF监测值<0.9，则使用舒更葡糖4 mg/kg进行拮抗，待TOF恢复至0.9时在手术室内拔除气管导管。患者术后均送入麻醉后恢复室(PACU)，连接电子止痛泵行颈静脉患者自控镇痛(PCIA)。

1.3 干预措施 OLV后研究组从非通气侧肺置入14 F导管于气管隆嵴分叉后2～3 cm，并给予1～4 L/min的持续性中-低流量给氧；对照组非通气侧肺不给予持续性中-低流量给氧，只在气管隆嵴分叉后2～3 cm置入14 F导管。

1.4 检测项目

1.4.1 血气分析 于麻醉诱导后即刻(T0)和OLV后30 min (T1)、1 h (T2)及2 h (T3)时采集桡动脉血，应用GEM Premier 3000血气分析仪(美国力康公司)进行血气分析。

1.4.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)采集 T3时在可视化双腔支气管导管的大、小套囊均鼓起的情况下对非通气侧肺进行BALF采集，由熟练操作纤维支气管镜的医师完成。选用BF-1T260型电子支气管镜(日本Olympus公司)，将其末端与两组患侧肺中叶或舌叶的叶支气管开口处紧密契合，缓慢注入37 ℃的医用0.9%氯化钠(NaCl)溶液，灌注后用50～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)负压吸引缓慢回收，回收率≥40%为回收成功，每次灌洗量为40 mL，共3次，总量为200 mL，BALF经双层无菌纱布过滤，4 ℃冷却10 min，再以3 000 r/min的转速(离心半径15 cm)离心15 min，留取上清液，置于-20 ℃以备后续检测用。

1.4.3 肺组织学评价 T3时切取已切除的肺癌外周的正常肺组织，置于4%中性甲醛溶液中固定、石蜡包埋、组织切片、H-E染色，并由对研究方案和分组不知情的病理科医师进行肺损伤评分[4]。

1.4.4 AM分选 利用Alex Fluor标记的CD11b抗体、PE-Cy7标记的Siglec F抗体和APC标记的CD11c抗体(美国Santa Cruz生物科技公司)标记人AM (CD11b-CD11c+Siglec F+)。从离心后的BALF上清液中收集细胞并制成细胞悬液，加入抗体，避光冰浴30 min，向离心管中加入1 mL流式缓冲液终止染色，迅速离心去除上清液，将细胞用200 μL流式缓冲液重悬，细胞滤网过滤后，使用MoFlo Astrios EQ流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)进行流式细胞分选。

1.4.5 AM凋亡检测 按试剂盒说明书进行操作，将分选出的AM与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)孵育，流式细胞术分析AM中的凋亡细胞比例。

1.4.6 AM表型检测 为判断AM的分化状态，使用美国Sigma公司的双抗体夹心法ELISA试剂盒，检测研究组和对照组离心后的BALF上清液中M1型AM标志物[诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-6]和M2型AM标志物[精氨酸酶1(Arg1)、IL-10]的水平。

1.4.7 活性氧(ROS)的测定 按试剂盒(美国Enzo Biochem公司)说明书进行操作，将分选出的AM细胞悬液与 DCFH-DA 荧光探针(10 μmol/L)混匀、孵育，用无血清细胞培养液洗涤细胞，经流式细胞仪检测，以前向散射(FS)和侧向散射(SS)，指示细胞光透射程度为参数，选取活细胞(大 FS 值，较小 SS 值)圈门，对门内的细胞进行ROS分析。以探针荧光读数的对数为横坐标，细胞数为纵坐标即为测定细胞内ROS水平的相对值。

1.4.8 Ca2+浓度的检测 按试剂盒(美国Enzo Biochem公司)说明书进行操作，将分选出的AM细胞悬液与Fluo4-AM工作液(浓度为2 μmol/L)混匀、孵育。通过流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度相对值。

2 结 果

2.1 两组患者一般和临床资料的比较 两组患者年龄、BMI、性别构成、ASA分级构成、术前FEV1/用力肺活量(FVC)、双肺通气时间、paO2、paCO2、OLV时间、手术时间、麻醉时间、术中失血量和输入液体量的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

A 对照组 B 研究组图1 两组患者肺组织病理学结果(H-E染色，×200)

表1 两组患者一般和临床资料的比较 (N=30)

2.2 两组患者不同时间点血气分析结果比较 与同组T0时比较，T1～T3时两组paO2均显著下降(P值均<0.05)，paCO2均显著升高(P值均<0.05)。T1～T3时研究组paO2均显著高于对照组(P值均<0.05)，paCO2均显著低于对照组(P值均<0.05)。见表2。

2.3 两组患者肺组织病理学结果 对照组T3时，术侧正常肺组织肺泡壁增厚、水肿，可见大量中性粒细胞和单核细胞，肺泡腔内可见较多炎性渗出液；肺间质明显增厚，可见大量炎症细胞浸润。研究组肺泡间隔增宽，毛细血管未见明显充血，小部分肺泡腔可见红细胞及炎性渗出液；肺间质炎症细胞浸润明显少于对照组。见图1。

2.4 两组患者肺损伤评分及AM凋亡率的比较 T3时，研究组肺损伤评分显著低于对照组(P<0.05)；研究组AM活细胞率显著高于对照组(P<0.05)，AM早期凋亡率和晚期凋亡率均显著低于对照组(P值均<0.05)。见表3。

2.5 两组BALF中M1型和M2型AM标志物的比较 研究组BALF中iNOS、IL-6和TNF-α水平均显著低于对照组，而Arg-1和IL-10水平均显著高于对照组(P值均<0.05)。见表4。

表3 两组患者T3时肺损伤评分及AM凋亡率的比较

表4 两组BALF中M1型和M2型AM标志物的比较

2.6 两组BALF中AM内Ca2+浓度和ROS水平的比较 研究组BALF中AM内的Ca2+浓度相对值显著高于对照组(10.81±2.83比7.64±2.31)，而ROS水平显著低于对照组(407±12比812±19，P值均<0.05)。

3 讨 论

OLV期间因机械通气不足引起的肺不张、氧合功能下降、炎症反应和肺损伤等，均可导致患者肺的病理生理学变化[5]。OLV时非通气侧肺虽不参与氧合作用，但仍然有血液供应，肺内分流率(Qs/Qt)值增加[6]。低氧血症是影响患者生理功能的最重要因素，是造成术中和术后严重并发症的主要原因[7]。当FiO2和血流动力学等指标相同时，OLV时肺泡-动脉氧分压差(A-aDO2)较双肺通气时更大，且paO2较双肺通气时更低。本研究结果表明，两组患者在OLV后出现不同程度的氧合功能下降，而OLV期间予非通气侧肺持续性中-低流量给氧则可改善OLV后肺的氧合，有效减少OLV后低氧血症的发生，对肺组织起到有效的保护作用。

据报道，通过纤维支气管镜以5 L/min的氧流量对非通气侧的肺部进行选择性供氧，可显著改善氧合，但不影响手术操作[8]。研究[9]结果表明，以5 L/min的氧流量进行的非通气侧肺持续给氧可以改善OLV期间的动脉氧合功能，并降低Qs/Qt，同时可将肺塌陷保持在最令手术医师满意的程度。本研究结果显示，研究组肺损伤评分显著低于对照组，提示术中非通气侧肺持续中-低流量给氧可减轻非通气侧肺损伤，这可能与其改善患者氧合功能有关。研究[10]结果表明，OLV诱发肺损伤的机制非常复杂，包括机械通气、低氧血症和氧化应激反应。本研究结果显示，OLV期间予非通气侧肺持续性中-低流量给氧，可减少低氧血症的发生，故其对OLV诱发的肺损伤亦有一定的减轻作用。

AM一般分为两种形态，即M1型巨噬细胞(CAM)和M2型巨噬细胞(AAM)。这两种形态是AM分化后两种极端对立的状态，在具体的肺部微环境中，AM各种表型之间并无明显界限，且根据局部微环境的变化不断进行着表型间的转换，维系一种微妙的平衡[11]。在机械通气的外源性刺激下，肺泡受损后分泌的炎症介质刺激AM，打破了这种平衡。本研究结果表明，与对照组比较，研究组AM释放大量的M1型和M2型标志物，细胞凋亡率显著增高，提示肺损伤时AM发生了异常的活化和分化。与对照组相比，研究组AM M1型标志物减少，M2型标志物增加，提示非通气侧肺持续中-低流量给氧对AM分化产生一定的影响，有效减少了CAM产生，增加AAM的产生。

急性肺损伤的过程中，AM通过分泌大量的氧化物参与免疫应激反应。在外界环境的刺激下，AM内的iNOS与Arg-1竞争性的结合底物精氨酸，分解成不同的产物。精氨酸与iNOS结合后，分解成瓜氨酸与NO。NO与超氧化物歧化酶(SOD)竞争性的结合细胞代谢过程中的ROS形成氧化剂与亚硝酸盐，使得肺泡上皮细胞通透性增加，从而导致急性肺损伤。而Arg-1与精氨酸结合后可分解为多胺和脯氨酸，促进了细胞分裂与胶原的形成，在炎症末期起到组织修复的作用[12]。本研究结果显示，与对照组相比，研究组iNOS、ROS水平均显著降低，而Arg-1水平显著增高，提示非通气侧肺持续中-低流量给氧能够通过改变AM内氧化物的水平，减轻急性肺损伤。

一磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)是重要的细胞代谢感受器，在炎症反应中起抑制作用，同时促进抗炎性的巨噬细胞极化[13]。AMPK促进巨噬细胞的M2型极化的途径较多，包括抑制 NF-κB和激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-δ、蛋白激酶B(Akt)等。而AMPK的激活需要钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)的调节，在肺组织损伤时，外源性Ca2+进入AM内，造成Ca2+超载。Ca2+与CaMKKβ结合诱导的相关级联反应使AMPK活化，进而使Janus激酶(JAK)2激活并催化酪氨酸残基发生磷酸化修饰，这些磷酸化的酪氨酸位点与STAT3结合并催化STAT3磷酸化，诱导AM向AAM转变；活化的AMPK抑制NF-κB激活，减弱AM向CAM转变[14]。本研究结果表明，研究组AM内的Ca2+浓度显著高于对照组，提示非通气侧肺持续中-低流量给氧可促进AM内Ca2+浓度升高，从而可能诱导AM向AAM转变，抑制AM向CAM转变。

综上，老年患者胸腔镜下肺癌根治术中非通气侧肺持续中-低流量给氧可调节异常AM的表型与功能，抑制AM凋亡，减轻非通气侧肺损伤。