生髓健骨胶囊对酒精性骨质疏松大鼠TNF-α、TGF-β1和空骨陷窝的影响

任树军，刘俊桐，于长江，姜 磊，谭福柱，申意伟，徐西林

（1. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040；3. 重庆三峡医药高等专科学校附属中医院，重庆 404000；4.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

酒精性骨质疏松症是指长期摄入过多的酒精后，骨的结构退变以致骨量缩减及易于发生骨折的周身性骨骼疾病［1］。据流行病学调查结果显示，人均年饮纯酒精量高达3.6 L［2］。研究表明酒精容易导致骨的代谢失衡，影响骨小梁的分布，从而导致骨折发生风险增加，甚至引起酒精性骨病。因此，完善相关研究对于预防酒精性骨质疏松就显得更为重要［3］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β1（TGF-β1）调控着骨的形成，主要包括细胞的分化、增殖以及功能活动［4］，与骨的代谢过程关系十分密切，其中TNF-α 是能够影响骨的代谢平衡并具有广泛活性的因子，是迄今为止发现最强的活性因子之一［5］；TGF-β1具有调节细胞生化和生长的活性因子功能［6-8］。空骨陷窝能够在镜下直观地反映骨骼被破坏的程度，空骨陷窝率是否降低是检测修复骨破坏的重要指标［9］。

本实验通过建立酒精性骨质疏松症大鼠模型，研究生髓健骨胶囊对酒精性骨质疏松大鼠TNF-α、TGF-β1及空骨陷窝率的影响，为指导临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由黑龙江中医药大学实验中心供应月龄平均为6 个月的成年雄性SD 大鼠（清洁级）120 只，体重（220±20）g，合格证号：SCXK（黑）20160103。

1.2 实验药物及器材

生髓健骨胶囊（黑龙江中医大一院制剂室，黑药制字Z20110036，执行标准：黑Z-ZJ-0560-2010，规格：0.35 g/粒）；碳酸钙片（规格：500 mg/片，吉林万通药业有限公司，批准文号：国药准字H10980201）；阿法D3（Teva Pharmaceutical Industries Ltd ，批准文号国药准字J20130162）；免疫组化试剂盒：SP Kit盒（小鼠P 物质受体SP-RELISA Kit 试剂盒）（上海信裕生物科技有限公司，批号：SP-0023）；白酒（规格：500 mL/瓶，红星牌55°二锅头白酒，北京红星有限股份公司，批号：B1707039，执行标准：QS1100-1501-0349）；0.9%NaCl 注射液（规格：500 mL/袋，四川太平洋药业有限公司，批号：1706150505）；苏木染色液及伊红染色液（上海科汇生物技术有限公司）；电子显微镜（XK-DS500A 型，深圳市西尼科光电有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验模型分组 在黑龙江中医药大学实验动物中心饲养的大鼠适应性喂养1 周后，按随机数字表法分为4 组，每组30 只，分笼喂养。

1.3.2 建立实验动物模型 模型组、西药对照组和中药干预组：每日上午均用白酒灌胃造模，剂量以10 mL/kg（酒精量4.4 g/10 mL）为准。模型组：下午用等量0.9%NaCl 注射液灌胃。每日一次。西药对照组：下午用碳酸钙、阿法D3 混悬液与0.9%Na-Cl 注射液配制混悬液灌胃（碳酸钙的用量标准为85 mg·10 mL-1·kg-1，阿法D3 的用量标准为0.05 μg·10 mL-1·kg-1）。每日一次。中药干预组：下午用生髓健骨胶囊与0.9%NaCl 注射液配制混悬液灌胃（用量标准为4.7 g·10 mL-1·kg-1）。每日一次。空白组：用等量0.9%NaCl 注射液每日上、下午灌胃两次。各组大鼠灌胃容量为10 mL/kg，灌胃给药时间为16周。实验期间，大鼠在同等条件下喂食，并根据每周的体重调整用药的剂量［10］。

1.4 取材及检测方法

于实验干预后的8、12、16 周时，各组随机抽取实验大鼠10 只，早晨空腹（以空腹10 h 以上为标准）用脊柱脱臼法处死后取右股骨上段做免疫组化检测，将提取的股骨组织做成玻片标本，在显微镜下进行试剂检测，以酶标记的抗体与组织进行有色反应，标记TNF-α、TGF-β1细胞因子，在电子显微镜下随机选取5 个视野记录TNF-α、TGF-β1数值。最后一次灌胃后，保持大鼠空腹状态，12 h 后采集标本，进行检测［11］。

解剖游离出左股骨，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，后置于15%乙二胺四乙酸中充分脱钙。常规脱水，石蜡包埋，切片厚度5 μm，行苏木精-伊红染色法（HE）染色。在光镜下观察骨小梁，骨髓腔，软骨下各级骨细胞和骨干组织的变化及空骨陷窝。每组随机任选10 个高倍视野，每个视野计数100 个骨陷窝，统计空骨陷窝数目，计算出空骨陷窝百分比，并进行显微摄影。

1.5 统计学处理

所有数据用SPSS21.0 软件进行处理，计量资料均数据以（±s）表示，各组间比较用单因素ANOVA 方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α 和TGF-β1表达分析

根据造模干预8、12、16 周末检测结果显示，与空白组相比，模型组的TNF-α 和空骨陷窝率明显升高，TGF-β1明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示大量酒精摄入能够导致实验大鼠的骨质破坏以及骨代谢平衡的紊乱。与模型组相比，西药对照组和中药干预组的TNF-α 和空骨陷窝率明显降低，TGF-β1明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示两种方式的药物干预能够维持实验大鼠的骨代谢平衡，同时骨破坏有所缓解。与西药对照组相比，中药干预组对指标的改善要优于西药对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1～3。

表1 8、12、16 周末各组大鼠股骨组织内TNF-α 阳性细胞数比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of rats femoral tissue TNF-α at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

表1 8、12、16 周末各组大鼠股骨组织内TNF-α 阳性细胞数比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of rats femoral tissue TNF-α at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，■P＜0.01；与西药对照组比较，□P＜0.05。

组别空白组模型组8 周末31.71±4.97 51.33±5.07*12 周末31.98±5.03 57.47±4.34*16 周末31.66±5.06 63.12±5.47*西药对照组50.16±4.91#48.93±5.14#47.47±4.83#中药干预组39.76±4.77■□38.27±5.34■□36.13±5.26■□FP 35.476 51.654 73.835＜0.01＜0.01＜0.01

表2 8、12、16 周末各组大鼠股骨组织内TGF-β1阳性细胞数比较（n=10，±s）Tab 2 Comparison of rats femoral tissue TGF-β1 at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

表2 8、12、16 周末各组大鼠股骨组织内TGF-β1阳性细胞数比较（n=10，±s）Tab 2 Comparison of rats femoral tissue TGF-β1 at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，■P＜0.01；与西药对照组比较，□P＜0.05。

组别空白组8 周末60.09±3.37 12 周末60.17±3.41 16 周末60.22±3.34模型组51.63±5.13*44.17±4.63*37.88±4.17*西药对照组47.87±5.13#49.13±4.38#51.11±4.46#中药干预组57.19±5.67■□56.97±4.25■□58.53±5.25■□FP 12.017 30.301 54.476＜0.01＜0.01＜0.01

表3 8、12、16 周末各组大鼠股骨组织内空骨陷窝率比较（n=10，±s）Tab 3 Comparison of rats femoral tissue Lacuna at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

表3 8、12、16 周末各组大鼠股骨组织内空骨陷窝率比较（n=10，±s）Tab 3 Comparison of rats femoral tissue Lacuna at 8th 12th and16 weekend（n=10，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，■P＜0.01；与西药对照组比较，□P＜0.05。

组别空白组模型组8 周末13.00±1.63 20.80±1.75*12 周末13.20±1.62 22.10±2.08*16 周末12.90±1.66 23.00±1.49*西药对照组19.70±1.64#19.20±1.55#18.10±1.91#中药干预组18.60±1.43■□17.90±1.79■□16.20±1.55■□FP 136.307 137.389 133.282＜0.01＜0.01＜0.01

2.2 空骨陷窝结果观察

根据8、12、16 周末实验大鼠骨组织HE 染色光镜观察结果显示：空白组骨小梁排列整齐、无断裂。髓腔形态规整、无扩大，有大量红骨髓存在。骨小梁上空骨陷窝数量稀少。软骨下骨表层光滑。模型组骨小梁数量减少、变细，排列紊乱。髓腔扩大，红骨髓减少，黄骨髓（脂肪组织）增多。骨小梁和骨干上空骨陷窝数量较空白组增多。骨干的骨细胞排列欠规整，少量细胞核固缩。西药对照组骨小梁排列欠规整，无明显断裂。髓腔形态欠规整，红骨髓比模型组增多，黄骨髓减少。骨小梁和骨干上空骨陷窝数量相对模型组减少。中药干预组骨小梁排列较规整、无断裂。髓腔形态无明显扩大，有大量红骨髓存在。骨小梁和骨干上空骨陷窝数量较模型组减少。软骨下骨表层较光滑。软骨下各级的骨细胞排列较整齐、均匀，成熟骨细胞相对增多。骨干的骨细胞排列较整齐，有少量核固缩。见图1。

图1 各组实验大鼠骨组织HE 染色结果（×400）Fig 1 The results of HE staining in bone tissue of rats in each group（×400）

3 讨论

长期摄入过量的酒精后，可造成骨皮质变薄、骨小梁减少、骨量缩减及骨代谢改变，从而导致骨折风险增加。成骨细胞与破骨细胞的动态平衡是维持骨代谢平衡的基础［12］。成骨细胞对骨生长的影响小于破骨细胞对骨吸收的影响是形成骨质疏松的根本原因［13］。研究显示TNF-α 在破骨细胞的前期阶段能够通过细胞表面受体的传导，刺激并形成新的破骨细胞，间接促进破骨细胞的快速分化以及破骨细胞的增殖和功能活性。因此TNF-α 能抑制破骨细胞的凋零并导致骨吸收的增加［14］。同时TNF-α 能抑制前成骨细胞的分化，抑制新骨的形成及钙化的过程，从而降低骨小梁数量、骨皮质密度［15］。成骨细胞的分化过程是骨基质的主要来源，而TGF-β1是骨基质中含量最多的活性因子之一。所以TGF-β1能够通过刺激成骨细胞从而促进新骨的形成和加快新骨钙化的进程［16］。同时TGF-β1能够促进前成骨细胞中活性因子的合成与重组，从而促进成骨细胞的生成及其功能活性的增强，并能通过抑制破骨细胞的表达从而降低其增殖和活性［17］。TGF-β1促进成骨细胞的增殖，促进其向成熟型转化，从而降低骨吸收维持骨代谢的动态平衡。因此，TGF-β1对骨的修补和构建有着重要作用。所以TGF-β1被认为是与骨代谢的平衡关联十分密切的因子［18］。

中医根据酒精性骨质疏松症其临床症状，将其归为“骨痿”的范畴。中医认为肾精不足、肾气不固是骨质改变的根本原因［19］。所以酒精性骨质疏松症其病变在骨，其本在肾［20］。脾为后天之本，主肌肉，为气血生化之源。肾虚则脾化生无力，脾虚则生化无源以资肾［21］。所以补肾益脾为治疗酒精性骨质疏松症的主要治则。生髓健骨胶囊由《医学正传》中鹿角胶丸化裁而成，方中以龟板和鹿角胶为主药，鹿角胶善于益肾养阳，龟板偏于益气滋阴，两药同用，阴阳并补，阳得阴助而生化无穷，阴得阳升而泉源不竭，阴阳共济故能补肾以资先天；以黄芪、熟地黄等为臣药，黄芪长善于升阳补气，熟地善于补血滋阴，血为气之母。气为血之帅，阴阳并补，故能健脾补后天，脾化生无穷［22］。前期研究显示生髓健骨胶囊对酒精性骨质疏松症有良好的治疗作用［23］。

文献显示过量饮酒可引起内分泌紊乱，促进TNF-α 的表达，从而加速破骨细胞的形成［24］。生髓健骨胶囊具有补肾健脾、强壮筋骨的功效，能够调节内分泌的紊乱状况，对成骨细胞的形成有促进作用。随着内分泌紊乱的纠正，抑制了TNF-α 的表达。生髓健骨胶囊调节大鼠的体内代谢，保证Wnt/BMP-2 通路的正常，促进骨细胞分泌TGF-β1。同时抑制成骨细胞的凋亡，促进成骨细胞分泌TGF-β1，并可以使IGF-1 促生长因子自身磷酸化从而促进TGF-β1表达。髋关节是主要的负重关节，正常情况下股骨头内骨小梁排列紧密，在股骨受压应力和剪切力集中区如股骨距，骨小梁明显增粗增多，这是长期演化的结果。但当某种致病因素打破骨代谢的平衡，破骨细胞活性增强，成骨细胞活性减弱，新骨生成减少而骨细胞坏死增加，继而出现空骨陷窝数增加，即空骨陷窝率升高［25］，导致骨质疏松。正常股骨头空骨陷窝率小于13%，空骨陷窝是骨细胞死亡的直接证据，直观地反映了骨坏死的程度［26］。生髓健骨胶囊通过调整骨代谢能够降低空骨陷窝率，提示对酒精性骨质疏松大鼠的骨破坏有一定的修复作用。

本课题实验结果显示生髓健骨胶囊能减弱酒精性骨质疏松大鼠骨组织中TNF-α 的表达，增强TGF-β1的表达，降低空骨陷窝率，维持骨代谢过程的动态平衡并对骨坏死具有一定的修复作用，达到防治酒精性骨质疏松的目的，为临床治疗提供依据和参考。

作者贡献度说明：

任树军：统筹实验，协调实验室与设备；刘俊桐、于长江：论文撰写；姜磊、谭福柱：记录及统计实验数据；徐西林、申意伟：实验室的日常维护及耗材的更新。